1. 论文基本信息

1.1. 标题

识别苦味和鲜味肽中的序列残基模式 (Identifying Sequential Residue Patterns in Bitter and Umami Peptides)

1.2. 作者

• Arghya Dutta: 德国马克斯·普朗克高分子研究所 (Max Planck Institute for Polymer Research)，现就职于歌德大学生物化学二所。
• Tristan Bereau: 荷兰阿姆斯特丹大学范特霍夫分子科学与信息学院 (Van 't Hoff Institute for Molecular Sciences and Informatics Institute, University of Amsterdam)。
• Thomas A. Vilgis: 德国马克斯·普朗克高分子研究所 (Max Planck Institute for Polymer Research)。

1.3. 发表期刊/会议

ACS Food Science & Technology。这是一个专注于食品科学与技术交叉领域的高质量学术期刊，由美国化学会 (American Chemical Society, ACS) 出版，在食品科学领域具有良好的声誉和影响力。

1.4. 发表年份

2022年

1.5. 摘要

这篇论文旨在探讨肽的氨基酸序列如何影响其味觉感知。由于肽序列空间呈指数级增长，且实验测量数据稀缺，建立严格的结构-性质关系极具挑战性。通过感官方法，许多肽已被识别为具有苦味或鲜味。现有的基线研究主要关注单一氨基酸的特性，例如苦味肽的疏水性 (hydrophobicity) 和鲜味肽的负电荷 (negative charges)。本研究通过提取序列氨基酸模式来细化这一认识。作者提出了一种粗粒度化 (coarse-grains) 肽序列空间的方法，以促进系统性地识别常见的残基模式。研究识别出苦味肽和鲜味肽的最佳模式分别为：一个疏水性 (hydrophobic) 残基后跟四个极性 (polar) 残基 (HPPPP)，以及两个负电荷 (negative) 残基后跟三个极性 (polar) 残基 (--PPP)。结果显示，与随机模式和上述基线模式相比，该方法实现了系统性的改进。该方法通过利用序列信息来帮助定位肽和蛋白质中特定味觉特性，从而补充了定量构效关系 (quantitative structure-activity relationship, QSAR) 方法。

1.6. 原文链接

/files/papers/69120b4ab150195a0db74a05/paper.pdf 发布状态：已正式发表。

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

• 论文试图解决的核心问题: 肽的氨基酸序列如何影响其味觉？具体来说，是否存在特定的氨基酸序列模式导致肽呈现苦味或鲜味？
• 为什么这个问题在当前领域是重要的:
  1. 味觉与食物选择: 味觉系统 (gustatory system) 对于识别安全和有害食物至关重要，并主导了人类的食物偏好。了解味觉触发机制有助于设计更营养、更可口的食品。
  2. 食品工业需求: 随着植物基食品 (plant-based foods) 的兴起，需要识别植物蛋白中能产生特定风味的短序列，以便通过热处理和酶解提取这些风味肽作为风味增强剂。
  3. 现有研究的局限性:
     • 序列空间巨大: 肽的可能序列组合呈指数级增长，使得全面探索和识别模式非常困难。
     • 数据稀缺: 缺乏大规模、经过实验验证的味觉肽数据，限制了传统方法（如定量构效关系 QSAR 或机器学习 ML）的准确性和普适性。
     • 可解释性不足: QSAR 方法通常依赖多维描述符，难以解释最终模型；ML 方法（尤其是深度学习）常被称为“黑箱”，难以提供直观的、可解释的味觉触发机制。
     • 关注点单一: 现有的基线研究主要关注单一氨基酸的特性（如苦味肽的疏水性，鲜味肽的负电荷），未能充分考虑氨基酸在序列中的相对位置和组合。
• 这篇论文的切入点或创新思路: 论文提出通过对氨基酸进行粗粒度化 (coarse-graining)，并系统地识别序列氨基酸模式 (sequential amino acid patterns)，来克服上述挑战。这种方法旨在降低序列空间的复杂性，并在有限数据下发现具有良好可解释性的通用味觉模式。

2.2. 核心贡献/主要发现

• 论文最主要的贡献:
  1. 提出了一种新颖、可解释的方法，用于系统地识别苦味和鲜味肽中的粗粒度序列残基模式。
  2. 通过将20种标准氨基酸粗粒度化为四种类型（疏水性 H、极性亲水性 P、带正电荷 +、带负电荷 -），有效降低了肽序列空间的维度。
  3. 引入序列重叠指数 (sequence overlap index) 作为味觉的代理度量 (surrogate measure)，使其能够在没有实际味觉标签的组合库肽上进行模式识别。
  4. 通过构建和探索不同长度的粗粒度肽库，系统地找到了“最佳”味觉模式，并解决了欠拟合 (underfitting) 和过拟合 (overfitting) 的问题。
• 论文得出了哪些关键的结论或发现:
  1. 苦味肽的最佳模式: 一个疏水性残基后跟四个极性残基，即 HPPPP。
  2. 鲜味肽的最佳模式: 两个负电荷残基后跟三个极性残基，即 --PPP。
  3. 模式的优越性: 这些识别出的模式在预测性能上显著优于随机模式和基于单一氨基酸特性的基线模式（苦味肽为“全疏水”，鲜味肽为“全负电荷”）。
  4. 可解释性与应用潜力: 提出的方法能够提供统计上稳健且易于解释的残基模式，可作为设计新型苦味和鲜味肽的模板，或用于在长蛋白质中定位潜在的味觉区域。
  5. 最小有效模式长度: 研究发现，当肽库的最大模式长度 $N$ 达到5时，预测能力趋于饱和，因此 $N=5$ 的模式被认为是最小且足够复杂的模式。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

• 肽 (Peptide): 由两个或多个氨基酸通过肽键 (peptide bond) 连接而成的化合物。它们是蛋白质水解的中间产物，在食品中具有重要的生理功能和感官特性，例如味觉活性。
• 氨基酸 (Amino Acid): 构成蛋白质的基本单位。自然界中约有20种常见的标准氨基酸。每种氨基酸具有独特的侧链 (side chain)，赋予其不同的理化性质，如疏水性、极性、电荷等。
• 味觉模态 (Taste Modalities): 指人类感知的基本味觉类型。主要包括甜 (sweet)、酸 (sour)、咸 (salty)、苦 (bitter) 和鲜 (umami)。本文主要关注苦味和鲜味。
  • 苦味 (Bitterness): 通常与有毒物质相关联，是一种警示味。
  • 鲜味 (Umami): 也称“旨味”或“美味”，通常与蛋白质的存在和饱足感相关联，是谷氨酸 (glutamic acid) 及其衍生物（如肌苷酸 disodium inosinate, GMP 或鸟苷酸 disodium guanylate, IMP）的独特味道。
• 粗粒度表示 (Coarse-Grained Representation): 在分子模拟和生物信息学中，粗粒度化是一种简化系统复杂性的方法。它通过将多个原子或分子基团合并为一个“粗粒度珠子”来减少自由度。在本研究中，20种不同的氨基酸被简化为4种具有代表性的理化类别（疏水性、极性亲水性、带正电荷、带负电荷），从而大大缩小了肽序列的可能空间。
• 疏水性 (Hydrophobicity): 氨基酸侧链“排斥水”的倾向。疏水性氨基酸通常侧链由非极性基团组成。Kyte-Doolittle (KD) 亲水性标度是衡量氨基酸亲水/疏水性的常用指标，正值表示疏水性，负值表示亲水性。
• 极性 (Polarity)/亲水性 (Hydrophilicity): 氨基酸侧链“吸引水”的倾向。极性氨基酸侧链通常含有氧、氮等电负性原子，形成不对称电荷分布，易与水形成氢键。
• 带电荷 (Charged): 氨基酸侧链在生理pH值下可以带正电荷（如赖氨酸、精氨酸、组氨酸）或负电荷（如天冬氨酸、谷氨酸）。电荷是影响肽与受体结合以及在水溶液中行为的关键因素。

3.2. 前人工作

• 定量构效关系 (Quantitative Structure-Activity Relationship, QSAR): 这是一种通过数学模型将化合物的化学结构或理化性质（描述符）与其生物活性（如味觉强度、毒性）关联起来的方法。在肽味觉研究中，QSAR被用于预测肽的阈值浓度、分类苦味/非苦味肽等。
  • Kim, H.-O.; Li-Chan, E. C. Y. (2006): 对苦味肽进行了QSAR研究。
  • Wu, J.; Aluko, R. E. (2007): 对苦味二肽和三肽进行了QSAR研究。
  • 特点: QSAR模型通常可解释，但依赖于预先定义的理化描述符，可能难以捕获复杂的非线性关系，且高维描述符可能降低模型可解释性。
• 机器学习 (Machine Learning, ML): 机器学习方法利用算法从大量数据中学习模式，以进行预测、分类或聚类。在肽味觉研究中，ML被用于：
  • Charoenkwan et al. (2020, 2021): 使用ML方法（如支持向量机、BERT模型）仅基于序列信息预测苦味和鲜味肽。
  • 特点: ML方法在预测准确性方面通常表现出色，尤其是深度学习模型，但常被视为“黑箱”模型，难以提供关于“为什么”一个肽具有某种味觉的直观解释。
• 基线模式 (Baseline Patterns): 之前的研究基于对单一氨基酸特性的观察，形成了一些关于苦味和鲜味肽的普遍共识：
  • 苦味肽基线: 通常认为疏水性氨基酸在苦味肽中占主导地位，因此“全疏水性肽”被视为苦味基线。
  • 鲜味肽基线: 负电荷氨基酸（如谷氨酸、天冬氨酸）被认为是鲜味的关键，因此“全负电荷肽”被视为鲜味基线。
• 序列位置的重要性: Charoenkwan et al. (2020) 和 Ishibashi et al. (1979) 的工作表明，残基的位置确实会影响肽的味觉，这与本研究关注序列模式的动机一致。

3.3. 技术演进

肽味觉的研究从最初关注单一氨基酸的理化特性（如疏水性、电荷）开始，逐步发展到使用定量构效关系 (QSAR) 方法，将多个理化描述符与味觉属性相关联。随后，机器学习 (ML) 方法，特别是基于序列信息的模型，进一步提高了预测准确性。然而，这些方法往往在可解释性方面存在不足，难以提供直观的序列模式。本研究则代表了从聚合属性分析和黑箱预测，向可解释的、关注序列中氨基酸相对位置的模式识别的演进。它试图在简化的粗粒度空间中，系统地发现能够解释味觉的通用序列“指纹”。

3.4. 差异化分析

• 与 QSAR 方法的差异:
  • 关注点: QSAR 通常关注聚合的理化性质（如整体疏水性、平均电荷、分子拓扑结构等）如何影响味觉。而本文方法则优先考虑氨基酸在序列中的相对位置和顺序，直接提取序列模式。
  • 可解释性: QSAR 模型虽然相对可解释，但当描述符数量增多或使用非线性降维技术时，其解释性会下降。本文方法通过粗粒度化和直接模式匹配，提供了更直观、更易于理解的序列模式。
  • 数据需求: QSAR 通常需要足够的描述符和标记数据。
• 与 ML 方法的差异:
  • 目标: ML 方法的主要目标通常是准确预测一个肽是否具有某种味觉，或预测其味觉强度。本文的目标是识别味觉相关的通用序列模式，而不是对单个肽进行预测或分类。
  • 可解释性: ML 方法（特别是深度学习模型）常被称为“黑箱”，很难直接从模型中提取出人类可理解的模式。本文方法直接输出可读的粗粒度序列模式，具有高度可解释性。
  • 数据需求: ML 模型，尤其是复杂的深度学习模型，通常需要大量的标记数据进行训练才能达到良好性能。本文方法通过粗粒度化降低了复杂性，使其在有限的实验数据下也能获得统计稳健的模式。
• 与现有基线方法的差异:
  • 现有基线（如“全疏水”苦味、“全负电荷”鲜味）仅关注单一氨基酸类型的整体丰度。本文方法则揭示了特定氨基酸类型组合成的序列模式在味觉决定中的作用，强调了序列中位置依赖性信息的重要性，是对现有基线认识的重大改进和细化。

4. 方法论

4.1. 方法原理

本研究的核心原理是：通过粗粒度化 (coarse-graining) 氨基酸序列，将复杂的20种氨基酸简化为少数几种具有代表性的理化类别，从而大幅缩小肽序列的搜索空间。在此简化的空间中，构建一个组合式的肽库 (combinatorial peptide library)。然后，利用一个序列重叠指数 (sequence overlap index) 来量化库中每个肽与已知苦味或鲜味肽的相似性，从而定义一个味觉代理度量 (surrogate measure)。通过统计分析，从库中识别出与已知苦味或鲜味肽具有最高平均重叠的通用序列模式 (generic residue patterns)。这种方法旨在在数据稀缺的情况下，提取出易于解释且具有统计稳健性的味觉相关序列特征，并强调残基在序列中的相对位置的重要性。

4.2. 核心方法详解

研究方法可以分为以下几个关键步骤：

4.2.1. 标记肽数据库的构建与筛选

首先，研究人员从现有文献中收集了已标记为苦味或鲜味的肽。

• 数据来源:
  • 主要来源于 Charoenkwan et al. 提供的数据库，其中包含299个苦味肽和140个鲜味肽。
  • 补充了 Ney 的研究中发现的24个新的苦味肽。
  • 补充了 Shiyan et al. 和 Liu et al. 等研究中发现的12个新的鲜味肽。
• 数据筛选:
  • 排除了单残基肽 (single-residue peptides)。
  • 排除了长度超过10个残基的肽 (peptides with more than 10 residues)。这是因为收集到的肽中有超过90%的肽长度在2到10个残基之间，且对更长肽的味觉共识较少，尤其是鲜味肽。
• 最终数据集: 筛选后得到292个苦味肽和146个鲜味肽，作为后续分析的基准。

4.2.2. 氨基酸的粗粒度表示

为了有效管理肽序列的巨大空间（20^n，其中 n 是肽长度），研究将20种标准氨基酸粗粒度化为四种理化类别。

• 分类依据: 主要依据 Kyte-Doolittle (KD) 亲水性标度 (KD hydrophobicity scale) 和氨基酸的电荷特性。
• 四种粗粒度类型:
  1. 疏水性 (Hydrophobic, H): KD 亲水性值 > 0 的氨基酸。包括：丙氨酸 (Ala)、半胱氨酸 (Cys)、异亮氨酸 (Ile)、亮氨酸 (Leu)、蛋氨酸 (Met)、苯丙氨酸 (Phe)、缬氨酸 (Val)。
  2. 极性亲水性 (Polar and Hydrophilic, P): KD 亲水性值 < 0 且不带电荷的氨基酸。包括：天冬酰胺 (Asn)、谷氨酰胺 (Gln)、甘氨酸 (Gly)、脯氨酸 (Pro)、丝氨酸 (Ser)、苏氨酸 (Thr)、色氨酸 (Trp)、酪氨酸 (Tyr)。
  3. 带正电荷 (Positively Charged, +): 在生理 pH 值 (7.4) 下带正电荷的氨基酸。包括：精氨酸 (Arg)、组氨酸 (His)、赖氨酸 (Lys)。
  4. 带负电荷 (Negatively Charged, -): 在生理 pH 值 (7.4) 下带负电荷的氨基酸。包括：天冬氨酸 (Asp)、谷氨酸 (Glu)。
• 示例: 鲜味肽 LLLPGELAK 在粗粒度表示下变为 HHHPP-HH+。
• 目的: 大幅减少可能序列空间的尺寸，例如二肽从 $20^2 = 400$ 减少到 $4^2 = 16$ 种粗粒度组合。

4.2.3. 粗粒度肽库的构建

为了系统地发现新的肽序列模式，研究构建了七个不断增大的、组合式的粗粒度肽库。

• 库的生成过程:
  1. 固定最大长度 (N): 每个库定义一个重复模式的最大长度 $N$，从 $N=1$ 到 $N=7$。
  2. 生成所有模式: 生成所有长度不超过 $N$ 的 coarse-grained 模式。总模式数量为 $\sum_{i=1}^{N} 4^i$。例如，对于 $N=3$，共有 $4^1 + 4^2 + 4^3 = 4 + 16 + 64 = 84$ 种模式。
  3. 模式重复构成肽: 将每个模式自身重复，生成一个任意长的肽（本研究设定为420个残基）。这种重复确保了模式的“通用性”和“代表性”。
  4. 去重: 保留库中唯一的完整肽序列。
• 库的规模:
  • $N=1$ 库：4个重复模式，4个独特肽，例如 ${H..., P..., +..., -...}$。
  • $N=3$ 库：84个重复模式，76个独特肽，例如 ${H..., -P..., +-H..., ...}$。
  • $N=7$ 库：21844个重复模式，21736个独特肽。
• 目的: 逐步增加模型复杂性，以避免欠拟合 (underfitting)（$N$ 过小）和过拟合 (overfitting)（$N$ 过大）。

4.2.4. 序列重叠指数的定义

为了比较粗粒度肽序列之间的相似性，研究采用了序列重叠指数 (Sequence Overlap Index)，它量化了两个序列在相同位置上残基匹配的数量。

• 定义: 遵循 Schilling et al. 的方法。
• 公式: $$I ( \mathrm { X } , \mathrm { Y } ) = \frac { \vert X \cap Y \vert _ { \mathrm { s e q } } } { \operatorname* { m i n } ( \vert X \vert , \vert Y \vert ) }$$
• 符号解释:
  • $I(\mathrm{X}, \mathrm{Y})$: 肽 $\mathrm{X}$ 和肽 $\mathrm{Y}$ 之间的序列重叠指数。
  • $\mathrm{X}$: 第一个粗粒度肽序列。
  • $\mathrm{Y}$: 第二个粗粒度肽序列。
  • $\vert X \cap Y \vert_{\mathrm{seq}}$: 肽 $\mathrm{X}$ 和肽 $\mathrm{Y}$ 之间位置依赖性残基匹配的数量。这意味着在相同的位置上，两个肽的残基类型必须相同。
  • $\operatorname{min}(\vert X \vert, \vert Y \vert)$: 肽 $\mathrm{X}$ 和肽 $\mathrm{Y}$ 中较短者的长度。
• 示例: 对于两个肽 --H++ 和 +H+--，它们在位置2和位置3有匹配（$H$ 和 +），所以匹配数为2。较短肽的长度是4（--H++），因此重叠指数为 $2/4 = 0.5$。
• 味觉代理度量 (Surrogate Measure): 对于库中的一个粗粒度肽，其苦味 (bitterness) 或鲜味 (umami-ness) 被定义为该库肽与所有来自训练集的粗粒度苦味（或鲜味）肽的平均重叠指数。

4.2.5. 最佳模式的识别与验证

研究的目标是找到最能代表苦味和鲜味肽的通用序列模式。

• 识别最佳模式:
  1. 计算所有库肽的味觉代理度量: 对于每个库（N=1到N=7），计算其中所有独特肽的苦味值和鲜味值。
  2. 选择前五名: 找出苦味值（或鲜味值）最高的五个肽。
  3. 确定最频繁残基: 对于这五个肽的重复模式中的每个序列位置，统计出现频率最高的残基类型（H, P, +, -）。
  4. 组合生成最佳模式: 依序合并这些最频繁的残基类型，得到该库对应的最佳模式。例如，如果N=3库中前五名苦味肽模式的第一个位置最常见的是H，第二个位置是P，第三个位置是P，则最佳模式为 HPP。
• 验证模式的鲁棒性:
  1. 数据分割: 将收集到的标记肽数据库分为80%的训练集和20%的测试集。为了保持苦味肽和鲜味肽的比例，采用了分层随机抽样 (stratified random sampling)。
  2. 重复训练: 将上述模式识别过程重复500次，每次使用不同的训练集（通过分层随机抽样生成），以确保识别出的模式具有统计稳健性。
  3. 评估准确性: 通过将识别出的最佳模式与测试集中的苦味/鲜味肽计算平均重叠，并与基线模式（全疏水苦味、全负电荷鲜味）和随机模式进行比较，来评估其准确性。
• 目标: 本方法旨在揭示通用残基模式，而非预测单个肽的味觉，因此这种基于平均重叠的评估方式是合适的。

4.2.6. 基线模式

为了定量评估所识别模式的性能，研究设定了两个基线模式，并增加了一个随机模式作为对照。

• 苦味基线: 一个由所有疏水性残基组成的肽 (e.g., HH...)。这代表了传统上对苦味肽的认识，即疏水性是关键因素。

• 鲜味基线: 一个由所有负电荷残基组成的肽 (e.g., --...)。这代表了传统上对鲜味肽的认识，即负电荷（如谷氨酸、天冬氨酸）是关键因素。

• 随机模式: 一个由随机选择的残基组成的肽。这用于评估模式识别的性能是否优于完全随机。

• 目的: 通过与这些基线模式的比较，验证所提出的方法在识别味觉相关序列信息方面的优越性，并评估残基相对位置的重要性。

  以下是原文 Figure 1 的内容，展示了研究所使用的方法流程图：

  该图像是示意图，展示了识别已知苦味和鲜味肽中常见粗粒度残基模式的方法。图中包括单位、粗粒度库及重叠指数等要素，帮助系统性地识别肽序列中的最佳模式。

Figure 1. Schematic diagram illustrating the method we used to identify the most common coarse-grained residue patterns present in known bitter and umami peptides.

5. 实验设置

5.1. 数据集

• 来源与组成:

  • 主要数据集来自 Charoenkwan et al. (2021) 的研究，包含299个苦味肽和140个鲜味肽。
  • 额外补充了 Ney (1979) 论文中的24个新苦味肽。
  • 额外补充了 Shiyan et al. (2021) 和 Liu et al. (2020) 论文中的12个新鲜味肽。

• 筛选标准: 移除了单残基肽 (single-residue peptides) 和长度超过10个残基的肽 (peptides with more than 10 residues)。这是因为超过90%的收集到的肽长度在2到10个残基之间，且对更长肽的味觉共识（特别是鲜味肽）存在争议。

• 最终数据集规模: 292个苦味肽和146个鲜味肽。

• 数据集特点:

  • 平均长度: 数据库中的苦味肽和鲜味肽平均长度约为4个残基。其中，约54%的肽只包含2或3个残基。
  • 粗粒度残基类型丰度 (Figure 2):
    • 苦味肽: 疏水性 (H) 残基约占42%，负电荷 (-) 残基约占5%。亲水性 (P) 残基和正电荷 (+) 残基也存在。
    • 鲜味肽: 负电荷 (-) 残基约占33%，疏水性 (H) 残基约占28%。亲水性 (P) 残基也大量存在。
    • 共同特征: 两种味觉肽都大量含有亲水性 (P) 残基，而正电荷 (+) 残基则相对稀少。

• 选择原因: 这些数据集都是从现有文献中经过实验验证的肽中编译而来，具有一定的可靠性。选择2-10个残基的肽范围是为了聚焦于短肽，因为它们在食品风味中通常扮演更直接的角色，且现有数据主要集中在这个长度范围。

  以下是原文 Figure 2 的内容，展示了数据库肽的理化性质：

  该图像是一个展示肽长度及其氨基酸组成的统计图，包含五个部分（a-e），分别展示了肽的长度、疏水性氨基酸百分比、正电荷氨基酸百分比和负电荷氨基酸百分比的分布情况。横轴为相关比例，纵轴为肽的数量，数据区分为苦味和鲜味肽。

5.2. 评估指标

本研究主要依赖于序列重叠指数 (Sequence Overlap Index) 及其衍生的平均重叠 (Average Overlap) 作为味觉代理度量和性能评估指标。

• 序列重叠指数 (Sequence Overlap Index, $I$)

  • 概念定义 (Conceptual Definition): 序列重叠指数是一种衡量两个粗粒度肽序列之间相似性的指标。它量化了在相同序列位置上，两个肽的粗粒度残基类型有多少是匹配的。为了标准化，这个匹配数会被其较短肽的长度进行归一化。该指标值越高，表示两个序列在位置上的一致性越强。
  • 数学公式 (Mathematical Formula): $$I ( \mathrm { X } , \mathrm { Y } ) = \frac { \vert X \cap Y \vert _ { \mathrm { s e q } } } { \operatorname* { m i n } ( \vert X \vert , \vert Y \vert ) }$$
  • 符号解释 (Symbol Explanation):
    • $I(\mathrm{X}, \mathrm{Y})$: 表示粗粒度肽序列 $\mathrm{X}$ 和 $\mathrm{Y}$ 之间的序列重叠指数。
    • $\mathrm{X}$: 第一个粗粒度肽序列。
    • $\mathrm{Y}$: 第二个粗粒度肽序列。
    • $\vert X \cap Y \vert_{\mathrm{seq}}$: 表示肽 $\mathrm{X}$ 和肽 $\mathrm{Y}$ 之间在相同序列位置上，粗粒度残基类型匹配的数量。例如，如果 $X = HPP$ 和 $Y = H+P$，则 $\vert X \cap Y \vert_{\mathrm{seq}} = 2$ (第一个H和第三个P匹配)。
    • $\operatorname{min}(\vert X \vert, \vert Y \vert)$: 表示肽 $\mathrm{X}$ 和肽 $\mathrm{Y}$ 中长度较短者的残基数量。这个操作用于将匹配数量归一化，使其值介于0到1之间。

• 平均重叠 (Average Overlap)

  • 概念定义 (Conceptual Definition): 在本研究中，平均重叠被用作衡量一个库肽（或一个预测模式）具有苦味或鲜味的代理度量。具体来说，一个库肽的苦味（或鲜味）值被定义为该库肽与所有已知苦味（或鲜味）肽（来自训练集或测试集）之间的序列重叠指数的平均值。这个度量允许研究人员在没有直接味觉标签的情况下，评估一个模式与具有特定味觉的肽集合的整体相关性。
  • 数学公式 (Mathematical Formula): (论文中未直接给出公式，但可根据描述推导) 对于一个库肽 $L$ 和一个口味类别的肽集合 $T = \{T_1, T_2, \dots, T_k\}$： $$\text{Average\_Overlap}(L, T) = \frac{1}{k} \sum_{i=1}^{k} I(L, T_i)$$
  • 符号解释 (Symbol Explanation):
    • $\text{Average\_Overlap}(L, T)$: 库肽 $L$ 与口味类别 $T$ 中所有肽的平均重叠值。
    • $L$: 库中的一个粗粒度肽序列或一个预测的模式。
    • $T$: 包含所有已知具有特定味觉（如苦味或鲜味）的粗粒度肽序列的集合。
    • $k$: 集合 $T$ 中肽的数量。
    • $I(L, T_i)$: 库肽 $L$ 与集合 $T$ 中的第 $i$ 个肽 $T_i$ 之间的序列重叠指数。

5.3. 对比基线

为了评估所识别模式的有效性和优越性，研究将它们与以下几种基线进行了比较：

• 苦味基线肽 (Bitter Baseline Peptide): 一个由所有疏水性 (H) 残基组成的肽，例如 HH...。这是基于传统认知，认为疏水性是苦味肽的关键特征。
• 鲜味基线肽 (Umami Baseline Peptide): 一个由所有负电荷 (-) 残基组成的肽，例如 --...。这是基于传统认知，认为负电荷（如谷氨酸、天冬氨酸）是鲜味肽的关键特征。
• 随机选择残基的肽 (Peptide with Randomly Chosen Residues): 这是一个通过随机选择粗粒度残基生成的肽，用于提供一个随机性能的参考，以衡量所识别模式的性能是否显著优于偶然情况。

6. 实验结果与分析

6.1. 核心结果分析

6.1.1. 数据库肽的理化性质

首先，研究分析了数据库中苦味肽和鲜味肽的理化特性，以验证其与现有共识的一致性。

• 肽长度: 平均而言，苦味肽和鲜味肽的长度约为4个残基。有趣的是，数据库中约54%的肽仅包含2或3个残基。这表明关于短肽味觉的共识较多，而长肽的味觉（特别是长鲜味肽）仍存在争议，这也凸显了探索长肽模式的重要性。

• 粗粒度残基丰度 (Figure 2b-e):

  • 亲水性 (P) 残基: 在苦味肽和鲜味肽中都大量存在，表明其在味觉肽中普遍存在。
  • 正电荷 (+) 残基: 在两种味觉肽中都相对稀少。
  • 疏水性 (H) 残基: 苦味肽中疏水性残基的含量（约42%）高于鲜味肽（约28%）。
  • 负电荷 (-) 残基: 鲜味肽中负电荷残基的含量（约33%）远高于苦味肽（约5%）。

• 结论: 这些观察与当前关于苦味肽由疏水性残基主导、鲜味肽由负电荷残基主导的共识相符。然而，苦味肽中亲水性残基的显著存在提示需要进行更系统的序列模式分析，而不仅仅是关注单一残基的丰度。

  以下是原文 Figure 2 的内容，展示了肽长度及其氨基酸组成的统计图：

  该图像是一个展示肽长度及其氨基酸组成的统计图，包含五个部分（a-e），分别展示了肽的长度、疏水性氨基酸百分比、正电荷氨基酸百分比和负电荷氨基酸百分比的分布情况。横轴为相关比例，纵轴为肽的数量，数据区分为苦味和鲜味肽。

6.1.2. 预测的苦味和鲜味模式

研究通过构建七个不同最大长度 $N$ 的肽库（从 $N=1$ 到 $N=7$），系统地识别了最佳苦味和鲜味模式。

• N=1 库:
  • 苦味: 预测为 $P$ (亲水性残基)。这是因为亲水性残基在苦味肽中总体上最常见（约46%），略高于疏水性残基（约42%）。
  • 鲜味: 预测为 - (负电荷残基)。这是因为负电荷残基在鲜味肽中总体最常见（约33%）。
  • 分析: 这种简单的模式被认为是欠拟合 (underfitting)，因为它没有足够高的复杂性来捕捉数据的细微差别。
• N=2 库:
  • 苦味: 预测为 PP (全亲水性残基)。虽然疏水性肽 HH 被认为是第二佳模式，但这与普遍认为苦味肽由疏水性残基主导的共识不符。这再次表明数据集中长肽中亲水性残基的比例较高可能会影响短模式的识别。
  • 鲜味: 预测为 -- (全负电荷残基)。这与文献共识一致。
• N=3 库及以上:

  • 从 $N=3$ 库开始，预测模式变得更加稳健。

  • N=3 库:

    • 苦味: 最佳模式为 HPP。第二佳模式 HPH 与 Xu et al. 的研究结果一致，该研究发现C端残基的疏水性和第二个残基的电子特性对三肽的苦味很重要。
    • 鲜味: 最佳模式为 --P。

  • N=4 库:

    • 苦味: 最佳模式为 HPpP。在位置1、3、4上与 Xu et al. 对四肽的研究结果吻合，但在第二个位置，徐等发现疏水性起作用，而本研究得到极性残基。

  • N=5 到 N=7 库:

    • 苦味: 模式演变为 {HPPPP, HPPPPH, HPPPPHH}。
    • 鲜味: 模式演变为 ${--PPP, --PPPH, --PPPHH}$。

  • 分析: 这些更长的模式为探索新的苦味和鲜味肽提供了有用的模板。值得注意的是，从 $N=2$ 开始，主导的残基类型在大部分序列位置上都保持相对稳定。在 $N=6$ 和 $N=7$ 的鲜味模式中，第六和第七个残基位置的不同类型竞争激烈。

    以下是原文 Figure 3 的内容，展示了不同最大长度 $N$ 下预测的最佳苦味和鲜味模式：

    该图像是一个表格，展示了苦味和鲜味肽在不同序列位置的概率分布。表中的数据分为两部分，分别对应于N从1到7的序列模式，标记为H（疏水性）、P（极性）和负电荷。此图用以支持研究中所识别的最佳氨基酸序列模式。

6.1.3. 最小肽模式的选择

为了回答应该选择哪个库的模式作为“最佳”模式，研究计算了不同库中预测模式与测试集肽的平均重叠。

• 平均重叠随 $N$ 的变化 (Figure 4a, b):
  • 对于苦味肽，$N=1$ 和 $N=2$ 库的预测模式（均为亲水性）的平均重叠高于全疏水性基线模式，这再次是由于苦味肽数据集中亲水性残基较多的“假象”。
  • 对于鲜味肽，$N=1$ 和 $N=2$ 库的预测模式（全负电荷）与基线模式（全负电荷）的重叠一致。
  • 随着 $N$ 的增加，预测模式的平均重叠稳步上升，直到 $N=5$ 达到平台期，之后不再显著增加。
• 选择 $N=5$ 库: 基于此观察，研究选择 $N=5$ 库作为最小的、足够大以避免欠拟合，且又不过于复杂以避免过拟合的库。
  • 预测模式:
    • 苦味: HPPPP (一个疏水性残基后跟四个极性残基)
    • 鲜味: --PPP (两个负电荷残基后跟三个极性残基)
• 性能改进 (Figure 4c, d):

  • 苦味肽: $N=5$ 库的预测苦味模式 HPPPP 与测试集肽的平均重叠（红色点）显著高于基线模式（黑色点，全疏水）和随机模式（灰色点）。这种改进对于苦味模式尤为明显。

  • 鲜味肽: $N=5$ 库的预测鲜味模式 --PPP 也显著优于随机模式，并与基线模式（全负电荷）表现相似（在 $N=1,2$ 处重叠）。

  • 结论: 预测模式显著改进了对已知苦味和鲜味肽的代表性，表明了该方法的准确性。

    以下是原文 Figure 4 的内容，展示了最大长度 $N$ 对模式重叠的影响以及 $N=5$ 模式的性能：

    该图像是图表，展示了不同最大单位长度 $N$ 对苦味与鲜味肽的重叠平均值的影响。面板 a 和 b 显示了随机模式、基线和预测模式的平均重叠情况，面板 c 和 d 则为 $N = 5$ 的模式与肽的重叠直方图，横线表示均值和标准差。

6.1.4. 蛋白质中的模式搜索示例

为了展示所提出方法的应用潜力，研究在已知与苦味相关的蛋白质中搜索了识别出的模式。

• Patatin-T5 (UniProt ID P15478) 和 Legumin-A (UniProt ID P287):
  • 将这些蛋白质的初级序列转换为粗粒度序列。
  • 搜索 $N=5$ 苦味模式 HPPPP，在 Patatin-T5 中找到了8个匹配片段，在 Legumin-A 中找到了5个匹配片段。这些片段的第一个残基位置也被标出。
  • 应用: 这提供了潜在的实验方向，以确定在何处切割蛋白质可以降低其苦味。
• Legumin-B (UniProt ID P16078) 示例 (Figure 5):

  • 该蛋白的初级结构被粗粒度化并着色。

  • 苦味模式 HPPPP (N=5): 找到了3个匹配片段（IPYWT, LGGNP, VNSQG），用灰色框标出。

  • 鲜味模式: 尽管在该蛋白中未找到 $N=5$ 鲜味模式 --PPP 的匹配，但搜索较短的鲜味模式：

    • $N=4$ 鲜味模式 --PP: 找到1个匹配片段（EEQQ）。
    • $N=3$ 鲜味模式 --P: 找到7个匹配片段（DEP, EEQ, EES, EEQ, EDT, EET, EEG），用蓝色框标出。

  • 应用: 这些匹配的短序列可以用于实验设计，例如通过酶切在特定位置来改变蛋白质的味觉特性，以创造新的植物源风味。

    以下是原文 Figure 5 的内容，展示了在 Legumin-B 蛋白质中搜索苦味和鲜味模式的示例：

    该图像是示意图，展示了蛋白质Legumin-B（Uniprot ID P16078）的氨基酸序列。序列以颜色编码，可能的苦味和鲜味肽分别用灰色和蓝色框标出。模式N=5: HPPPP、N=3: --P和N=4: --PP展示了优化的氨基酸序列特征。

6.2. 数据呈现 (表格)

本研究的原文中未包含需要转录的传统数据表格。实验结果主要通过图表（Figure 2, 3, 4, 5）进行展示和分析。Figure 3 以可视化方式呈现了不同 $N$ 值下识别出的粗粒度模式，类似于一个结果总结表，但其内容已在 6.1.2. 预测的苦味和鲜味模式 中进行了详细描述和分析。Figure 4 则展示了模式性能的图表对比。

6.3. 消融实验/参数分析

论文中没有明确提及消融实验 (ablation studies) 来验证模型组件的有效性。然而，通过构建七个不同最大长度 $N$ 的肽库并分析其性能，作者隐式地进行了模型复杂性 (model complexity) 的参数分析。

• 参数 $N$ 的影响:
  • $N=1$ 和 $N=2$ 库被发现具有欠拟合 (underfitting) 的问题，即模式过于简单，无法充分代表味觉肽的复杂性。
  • 随着 $N$ 的增加，模式的平均重叠持续提高，直到 $N=5$ 时达到饱和，之后再增加 $N$ 并不会带来显著的性能提升。
  • 结论: 这种系统性的探索使得研究能够确定 $N=5$ 为一个最佳的折衷点，在模型复杂性、计算成本和模式的代表性之间取得了平衡，从而选择了 $N=5$ 库所产生的模式作为最终结果。这可以被视为一种探索最优参数（模式长度）的过程，尽管不是传统意义上的组件消融。
• 训练集/测试集划分与重复: 将数据划分为80%训练集和20%测试集，并重复500次，是为了确保预测模式的统计稳健性和泛化能力，而非消融实验。它主要用于评估模型对未见数据的表现，并量化结果的变异性。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究提出了一种新颖、可解释的方法，用于系统性地识别苦味和鲜味肽中的序列残基模式。通过将20种标准氨基酸粗粒度化为四种理化类别（疏水性 H、极性亲水性 P、带正电荷 +、带负电荷 -），研究人员显著降低了肽序列空间的维度。在此基础上，构建了七个不同最大模式长度 $N$ 的组合肽库。利用序列重叠指数 (sequence overlap index) 作为味觉的代理度量，研究识别出与已知苦味和鲜味肽具有最高平均重叠的模式。

经过80%-20%的训练-测试集划分和500次重复验证，研究最终确定 $N=5$ 的模式为最佳选择，它们在模型复杂性和性能之间达到了平衡。识别出的最佳模式为：

• 苦味肽: HPPPP (一个疏水性残基后跟四个极性残基)。

• 鲜味肽: --PPP (两个负电荷残基后跟三个极性残基)。

  这些预测模式与基线模式（苦味为全疏水，鲜味为全负电荷）以及随机模式相比，展现出显著的优越性，尤其是在苦味模式方面。该方法的核心优势在于其可解释性和在有限实验数据下识别统计稳健模式的能力，能够帮助研究人员在长蛋白质中定位潜在的味觉区域，并为设计新型味觉肽提供有价值的模板。

7.2. 局限性与未来工作

• 作者指出的局限性:
  • 粗粒度化的限制: 尽管粗粒度化有助于降低维度和提高可解释性，但它也可能丢失氨基酸之间细微的理化差异。作者指出，可以包含更多的理化描述符，但这会增加粗粒度单元的数量，进而增加预测模式的不确定性。
  • 未考虑构象和电荷分布: 作者明确指出，本方法并非设计用于回答味觉如何受肽构象或残基电荷分布等特定理化性质影响的问题，而这些是 QSAR 或 ML 模型可能更擅长处理的。
• 作者提出的未来研究方向:
  • 扩展到其他味觉模态: 该方法不限于苦味或鲜味，可以很容易地应用于识别其他肽味觉模态的残基模式。
  • 体外合成与验证: 新设计的肽可以通过体外合成 (in vitro synthesis) 后进行感官评估，或通过体外方法（如分子对接 molecular docking）进行验证。
  • 在植物基食品中的应用: 该方法对于在植物基肉类替代品中识别肽味觉特征变得越来越重要。
  • 酶切指导: 识别出的模式可用于指导酶切点，以通过特异性酶解来调控水解产物的味觉特性。

7.3. 个人启发与批判

• 个人启发:
  1. 粗粒度化与可解释性: 这篇论文提供了一个很好的案例，说明在数据稀缺和复杂度高的问题中，粗粒度化是实现模型可解释性和鲁棒性的有效策略。它通过牺牲部分细节，换取了对核心模式的清晰洞察。
  2. 序列信息的重要性: 强调了生物活性不仅取决于组分，更取决于序列顺序。传统的聚合属性方法往往忽略这一点，而本文的序列模式识别有效地捕捉了位置依赖性信息。
  3. 互补性而非竞争性: 作者明确指出其方法与 QSAR 和 ML 并非竞争关系，而是互补的。这提醒我们在科学研究中，不同的方法有其独特的优势和适用场景，结合使用可以提供更全面的理解。
  4. 工程应用潜力: 识别出的具体模式 HPPPP 和 --PPP 具有直接的工程应用价值，可以作为指导肽设计和蛋白质改造的“设计规则”，例如，在植物蛋白中寻找具有特定口味潜力的区域，或通过基因工程/酶解来增强或消除某种味道。
• 批判:
  1. 粗粒度损失信息: 尽管粗粒度化是必要的简化，但它无疑会丢失氨基酸侧链的详细理化信息，例如不同疏水性氨基酸（如亮氨酸和苯丙氨酸）在形状、大小和柔韧性上的差异。这些细微的差异可能在某些情况下对味觉受体结合至关重要。
  2. 模式的生物物理机制: 论文成功识别了模式，但并未深入探讨这些模式背后具体的生物物理机制，即为什么 HPPPP 会引起苦味，或者 --PPP 会引起鲜味。未来的工作可以结合分子动力学模拟或受体结合实验来验证和阐明这些模式的作用机制。
  3. 重复模式的假设: 库中肽是由重复模式构成的，这可能过于简化现实世界的肽序列。虽然有助于识别通用模式，但可能无法完全捕捉非重复或更复杂模式的贡献。
  4. 数据依赖性: 尽管方法在有限数据下表现良好，但其发现的模式仍然依赖于现有数据库的质量和偏差。如果数据库中的肽存在未被识别的偏见（例如，某些长度或类型的肽被过度代表），则识别出的模式也可能受到影响。文中提到“对于一些较长的鲜味肽，共识较少”，这可能影响了模式的泛化性。
  5. 线性模式限制: 目前的模式是线性的，未考虑肽链在三维空间中的折叠、结构域相互作用以及与味觉受体或其他共配体 (co-ligands) 的复杂相互作用。这些高级结构信息对于味觉感知可能至关重要。