Virus-inspired lipopeptide-derived nucleic acid delivery to cartilage for osteoarthritis therapy

Chong Li

论文状态：已完成

Virus-inspired lipopeptide-derived nucleic acid delivery to cartilage for osteoarthritis therapy

发表：2025/10/16

骨关节炎治疗 (2)病毒启发的脂肽纳米颗粒 (1)基因传递载体优化 (1)软骨靶向基因疗法 (1)抗氧化应激响应系统 (1)

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TL;DR 精炼摘要

本研究开发了一系列病毒启发的脂肽基纳米颗粒(VPN)，用于骨关节炎的核酸递送。优化的VPN-2比传统脂质纳米颗粒的转染效力提高约2.5倍，并在活性氧响应的凝胶系统中有效减轻了小鼠的软骨退变，展示了其在软骨靶向基因疗法中的巨大潜力。

摘要

Cartilage-targeted gene therapy is promising for osteoarthritis (OA) treatment, though its potency critically depends on the effectiveness of delivery vectors. Here, we modularly develop a series of non-pathogenic, virus-inspired lipopeptide-based nanoparticles (VPN) tailored to deliver nucleic acids to cartilage. The optimized VPN-2 achieves about 2.5-fold improvement in transfection potency over conventional lipid nanoparticles. si-VPN-2, formulated into a ROS-responsive nano-in-gel system, alleviates cartilage degeneration in surgical ACTL mice and synergizes with methylprednisolone for joint protection in PTOA mice, highlighting its potential as a cartilage-targeted RNA delivery vector for innovative OA therapy.

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1. 论文基本信息

1.1. 标题

Virus-inspired lipopeptide-derived nucleic acid delivery to cartilage for osteoarthritis therapy (病毒启发的脂肽衍生的核酸递送至软骨用于骨关节炎治疗)

1.2. 作者

Yu Fu, Yulan Huang, Yunjiao Wang, Zhenlan Fu, Wenyun Cai, Lu Wang, Yuchun Wu, Xing Zhou, Zhongyi Ma, Zhigang Xu, Yaqin Tang, Jing Xie, Jiayun Jiang, Robert J. Lee, Chong Li

1.3. 发表期刊/会议

Nature Communications

1.4. 发表年份

Published online: 16 October 2025 (UTC)

1.5. 摘要

软骨靶向基因疗法 (Cartilage-targeted gene therapy) 在骨关节炎 (Osteoarthritis, OA) 治疗中具有广阔前景，但其疗效关键取决于递送载体的有效性。本研究模块化地开发了一系列非致病性、病毒启发的脂肽基纳米颗粒 (Virus-inspired lipopeptide-based nanoparticles, VPN)，专门用于向软骨递送核酸。优化后的 VPN-2 在转染效力方面比传统脂质纳米颗粒 (Lipid Nanoparticles, LNP) 提高了约2.5倍。si-VPN-2 被进一步配制成活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS) 响应的凝胶内纳米系统 (nano-in-gel system)，结果显示其能减轻手术诱导的 ACLT (Anterior Cruciate Ligament Transection) 小鼠的软骨退变，并与甲泼尼龙 (methylprednisolone) 协同作用，在 PTOA (Post-traumatic Osteoarthritis) 小鼠中实现卓越的关节保护。这突出表明 VPN 作为软骨靶向 RNA 递送载体，在创新性 OA 疗法中的巨大潜力。

1.6. 原文链接

/files/papers/691763e0110b75dcc59ae089/paper.pdf 发布状态：已正式发表。

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

骨关节炎 (OA) 是一种严重的疾病，其治疗需求尚未得到满足，主要原因是目前缺乏能够延缓软骨退变的疾病修饰性 OA 药物 (Disease-Modifying OA Drugs, DMOADs)。当前的药物管理主要侧重于缓解症状，如炎症和疼痛，但无法阻止软骨的结构性损伤。关节软骨的损失是 OA 的标志性特征，其中基质金属蛋白酶 13 (MMP-13) 被认为是导致 OA 进展的最具致病性的蛋白水解驱动因子，因为它能够有效降解软骨的关键结构成分，特别是 II 型胶原 (Col2)。

然而，针对 MMP-13 的小分子抑制剂在临床转化中面临挑战，主要源于低选择性相关的安全问题。RNA 干扰 (RNAi) 疗法通过序列特异性方式沉默 MMP-13 基因表达，为解决这一选择性问题带来了新突破。然而，核酸本身内在不稳定，难以有效到达靶点并发挥功能，因此其治疗潜力在很大程度上依赖于高效的递送载体。

现有递送载体存在各自的局限性：

病毒载体 (Viral Vectors)：如腺病毒和逆转录病毒，能有效将基因货物转运到宿主细胞中，但其固有的免疫原性 (immunogenicity) 和致病性 (pathogenicity) 限制了其临床应用。
非病毒载体 (Non-viral Delivery Vehicles)：以离子化脂质配制的脂质纳米颗粒 (LNP) 为代表，被开发为更安全、易于生产的替代品。尽管 LNP 技术已成功用于肝脏疾病的 siRNA 疗法和 mRNA 疫苗的临床转化，但在肝外组织中的应用因转染能力有限而受阻。
软骨递送的挑战 (Cartilage Delivery Challenges)：软骨是一种无血管组织，具有致密、高度阴离子的细胞外基质 (extracellular matrix)。靶向软骨细胞（软骨中唯一的常驻细胞）的递送载体面临穿透 (penetration) 与滞留 (retention) 的两难困境。小尺寸纳米载体易于穿透软骨，但由于滑液的快速更新而迅速清除；大尺寸载体（如微粒或水凝胶）能更好地滞留在关节内，但难以穿透软骨组织。

为了克服这些挑战，本研究旨在开发一种新型的、高效且安全的核酸递送系统，能够特异性地靶向软骨、有效转染细胞并解决穿透与滞留的矛盾，从而为 OA 治疗提供创新方案。

2.2. 核心贡献/主要发现

本研究的核心贡献和主要发现如下：

开发病毒启发式脂肽纳米颗粒 (VPN) 平台：研究者模块化设计了一系列非致病性、病毒启发的脂肽，这些脂肽能够自组装形成纳米颗粒，有效地将核酸递送至软骨。这些脂肽具有三个功能模块：靶向头 (Col2-targeting peptide WYRGRL)、带有可变精氨酸和组氨酸残基的阳离子部分，以及疏水部分。
优化 VPN-2 结构并实现高效转染：通过体外筛选，具有 $- [ ( { \bf R } ) _ { 5 } - ( { \bf H } ) _ { 4 } ] _ { 2 } .$ 阳离子部分的 VPN-2 被鉴定为最佳载体。它能够有效促进细胞内吞 (endocytosis) 和溶酶体逃逸 (lysosomal escape)，在转染效力上比传统 LNP 提高了约 2.5 倍，并能高效沉默 MMP-13 的基因表达。
构建 ROS 响应性凝胶内纳米系统 (si-VPN@HA) 克服穿透-滞留困境：为了平衡在关节软骨内的穿透和滞留，研究者将 si-VPN-2 包裹在 ROS 响应的透明质酸水凝胶中 (si-VPN@HA)。该系统在 OA 炎症微环境中的高 ROS 刺激下可解聚并缓慢释放 si-VPN-2，从而显著延长关节内滞留时间（超过 21 天），同时保持 si-VPN-2 良好的软骨穿透能力。
体内 OA 治疗的有效性：
- 在手术诱导的 ACLT 小鼠模型中，si-VPN@HA 有效减轻了软骨退变，降低了 MMP-13 表达，减少了炎症，并缓解了疼痛。
- 在创伤后骨关节炎 (PTOA) 小鼠模型中，si-VPN@HA 与临床标准糖皮质激素甲泼尼龙 (methylprednisolone, MP) 协同作用，实现了卓越的关节保护，有效抑制了骨赘形成和异位矿化，并改善了软骨下骨微结构。
证明 mRNA 递送潜力：初步评估显示，VPN-2 也能有效地进行关节内 mRNA 递送，例如 eGFP mRNA，证明了该平台作为通用核酸递送载体的多功能性。
生物安全性良好：初步体外和体内评估显示 si-VPNs 具有良好的细胞相容性和生物安全性，未引起显著溶血、细胞毒性或不良反应。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

骨关节炎 (Osteoarthritis, OA)：一种进行性、退行性关节疾病，以关节软骨破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成、滑膜炎症等为主要特征，导致关节疼痛、僵硬和功能障碍。
基因疗法 (Gene Therapy)：通过导入、替换或修改基因来治疗疾病的方法。在 OA 治疗中，通常指通过递送核酸（如 siRNA、mRNA）来调控特定基因的表达，以达到治疗目的。
小干扰 RNA (small interfering RNA, siRNA)：一种双链 RNA 分子，能够特异性地结合并降解靶 mRNA，从而沉默特定基因的表达。
信使 RNA (messenger RNA, mRNA)：携带遗传信息从 DNA 到核糖体，指导蛋白质合成的单链 RNA 分子。递送 mRNA 可以使细胞直接产生治疗性蛋白质。
递送载体 (Delivery Vectors)：用于将核酸或其他治疗剂输送到靶细胞或组织中的载体。分为病毒载体和非病毒载体。
病毒载体 (Viral Vectors)：基于病毒（如腺病毒、慢病毒）改造而成的基因递送系统，具有高效感染细胞和基因表达能力，但存在免疫原性和致病性风险。
非病毒载体 (Non-viral Vectors)：不基于病毒的基因递送系统，通常由脂质、聚合物或肽组成，具有较低的免疫原性和较好的生物安全性，但转染效率可能低于病毒载体。
脂质纳米颗粒 (Lipid Nanoparticles, LNP)：由可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质组成的纳米级颗粒，能够包裹核酸（如 mRNA、siRNA）并促进其进入细胞，已广泛用于疫苗和基因疗法。
细胞穿透肽 (Cell-Penetrating Peptides, CPPs)：一类能够穿透细胞膜并进入细胞内部的短肽。许多 CPP 富含精氨酸 (arginine) 残基，如 TAT 肽。
精氨酸 (Arginine)：一种带正电荷的氨基酸，其胍基团可以与细胞膜上的负电荷相互作用，促进肽段或纳米颗粒的细胞内化。
组氨酸 (Histidine)：一种具有咪唑基团的氨基酸，其 pKa 值约为 6.0。在酸性环境下（如溶酶体内部的 pH 值降低），组氨酸的咪唑基团会被质子化，导致肽段膨胀并破坏溶酶体膜，促进货物逃逸到细胞质中，即“质子海绵效应 (proton sponge effect)”。
脂肽 (Lipopeptide)：由肽段和脂质部分组成的嵌合分子。脂质部分提供疏水性，促进自组装形成纳米结构，肽段部分可赋予生物活性（如靶向、穿透）。
纳米颗粒 (Nanoparticles)：尺寸在 1-1000 纳米范围内的粒子，具有高表面积体积比和特殊的物理化学性质，在药物递送中应用广泛。
胶束 (Micelles)：由两亲性分子在溶液中自组装形成的纳米结构，疏水部分向内聚集，亲水部分向外暴露。
脂质体 (Liposomes)：由脂质双层膜构成的囊泡，可以包裹水溶性药物，常用于药物递送。
囊泡 (Vesicles)：一种由脂质双层或单层膜包围的细胞器或人工结构。
活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)：生物体内产生的一类含氧的自由基和非自由基物质，如过氧化氢 ( $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ )、超氧阴离子等。在炎症和 OA 进展中，ROS 水平通常升高。
透明质酸水凝胶 (Hyaluronic Acid Hydrogels, HA hydrogels)：透明质酸 (HA) 是一种天然存在的多糖，是关节软骨和滑液的主要成分。HA 水凝胶具有良好的生物相容性和可注射性，可用于关节内递送。
基质金属蛋白酶 13 (Matrix Metalloproteinase 13, MMP-13)：一种胶原酶，在 OA 进展中扮演关键角色，能够降解 II 型胶原和蛋白聚糖，导致软骨破坏。
表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR)：一种生物物理技术，用于实时监测生物分子之间的相互作用（如结合亲和力、动力学）。
耗散粒子动力学 (Dissipative Particle Dynamics, DPD)：一种介观尺度的分子模拟方法，用于模拟复杂流体和软物质体系的动力学行为，可以研究纳米颗粒的自组装过程。
流式细胞术 (Flow Cytometry)：一种快速分析细胞群体中单个细胞特性的技术，可用于定量细胞摄取、基因表达等。
免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)：利用荧光标记的抗体检测细胞或组织中特定蛋白质的技术。
逆转录定量聚合酶链反应 (Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)：用于定量检测 mRNA 表达水平的技术。
RNA 测序 (RNA Sequencing, RNA-Seq)：高通量测序技术，用于分析细胞或组织中所有 RNA 分子的丰度和序列信息，从而研究基因表达谱。
微型计算机断层扫描 (Micro-Computed Tomography, Micro-CT)：一种高分辨率的 X 射线成像技术，用于观察生物组织（如骨骼）的三维结构和形态学特征。

3.2. 前人工作

病毒载体与 LNP 的局限性：
- 病毒载体：尽管在基因转导方面效率高，但其固有的免疫原性（如引起宿主免疫反应）和潜在致病性（如病毒整合到宿主基因组可能引发突变），严重限制了其在临床上的广泛应用，特别是在长期治疗中。
- LNP：作为非病毒载体的代表，虽然在安全性与生产便利性方面优于病毒载体，并在肝脏疾病治疗和 mRNA 疫苗中取得成功，但其在肝外组织，特别是像软骨这样独特的组织中，转染效率往往不尽人意。这主要是由于 LNP 穿透特定组织屏障的能力受限以及细胞摄取机制的差异。
病毒启发式肽的设计：
- 为了结合病毒载体的高效性与非病毒载体的安全性，研究人员开始设计病毒模仿的、非致病性载体。
- 病毒衍生的细胞穿透肽 (CPPs)：许多病毒蛋白含有富含精氨酸的 CPPs (如 HIV 来源的 TAT 肽和单纯疱疹病毒来源的 VP22 蛋白)，它们能够通过静电相互作用与细胞膜结合，促进基因材料内化。这些肽段常用于浓缩基因材料以进行细胞内递送。
- 聚组氨酸融合 CPPs (Polyhistidine-fused CPPs)：为了进一步提高基因转染效率，研究发现将聚组氨酸序列与 CPPs 融合 (如 TAT-10H) 可以增强内涵体溶解能力。组氨酸的咪唑基团在酸性环境下（如内涵体/溶酶体）会被质子化，引发“质子海绵效应”，导致内涵体膨胀破裂，从而促进核酸从内涵体中逃逸到细胞质中，避免在溶酶体中降解。
软骨靶向与递送策略：
- Col2 靶向肽 WYRGRL：已有的研究表明，特定肽段如 WYRGRL 具有对 II 型胶原 (Col2) 的高亲和力，可用于实现软骨的非共价靶向结合。这对于提高载体在软骨组织中的局部浓度至关重要。
- 软骨递送的穿透与滞留困境：关节腔内给药面临一个固有的矛盾：小尺寸纳米载体虽然容易穿透软骨基质到达软骨细胞，但由于滑液的快速生理周转而易于被清除，导致滞留时间短；而大尺寸载体（如微粒或水凝胶）虽然能更好地滞留在关节内，但其体积限制了其穿透致密的软骨组织。解决这一矛盾是关节内递送的关键挑战。

3.3. 技术演进

该领域的技术演进可以概括为从单一、有缺陷的递送策略向多功能、集成化、智能响应型载体系统的发展：

早期病毒载体时代：最初的基因疗法主要依赖病毒载体，因其高效的基因转导能力而备受青睐。然而，严重的免疫原性和潜在的致病性（如基因随机整合导致的插入突变）使其应用受限。
非病毒载体兴起：为了规避病毒载体的缺点，脂质纳米颗粒 (LNP) 和聚合物纳米颗粒等非病毒载体逐渐发展起来。它们在生物安全性、可控性和大规模生产方面具有优势，并在 mRNA 疫苗和某些肝脏疾病的 siRNA 治疗中取得了突破。但其在肝外组织（如软骨）的递送效率和特异性仍有待提高。
病毒启发式设计：为了弥补非病毒载体效率不足的问题，研究者从病毒的高度进化性中汲取灵感。通过将病毒源性的高效转染元件（如富含精氨酸的 CPPs）整合到非病毒载体中，或通过模拟病毒的某些感染机制（如增强内涵体逃逸能力），旨在提高载体的转染效率和组织穿透能力。
软骨特异性递送的需求：随着对 OA 发病机制的深入理解，软骨作为主要治疗靶点的重要性日益凸显。这促使研究者开发具有软骨靶向能力的载体（如使用软骨亲和肽），以及能够解决软骨组织特殊物理屏障（如致密的细胞外基质、无血管性）和穿透-滞留矛盾的智能递送系统。
智能响应型递送系统：为了在复杂生物环境中实现精确递送和按需释放，响应性材料成为研究热点。例如，利用 OA 炎症微环境中高水平的活性氧 (ROS) 作为触发信号，设计 ROS 响应性水凝胶，实现载体的缓释和局部分散，从而优化药物在靶组织的药代动力学行为。

本文的工作正处于这一技术演进的最新阶段，它巧妙地结合了病毒启发式设计（脂肽的阳离子部分模拟 CPPs 和聚组氨酸的溶酶体逃逸功能）、软骨靶向策略（WYRGRL 肽）以及智能响应性（ROS 响应水凝胶）的优点，旨在构建一个多功能、高效且安全的软骨靶向核酸递送平台，以克服现有方法的局限性。

3.4. 差异化分析

本文的方法与相关工作中的主要方法相比，核心区别和创新点在于其多模块集成和智能响应性设计，旨在全面克服软骨基因递送面临的挑战：

病毒启发式脂肽的创新设计：
- 区别于传统 LNP：传统的 LNP 主要是通过离子化脂质包裹核酸，其组成和结构相对固定，在肝外组织的转染效率有限。本文的 VPN 采用模块化设计的脂肽，其阳离子部分（精氨酸和组氨酸残基）直接借鉴病毒来源的 CPPs 和聚组氨酸的功能。这种设计赋予了 VPN 优异的细胞内吞和溶酶体逃逸能力，从而显著提高了核酸的转染效率（比 LNP 提高约 2.5 倍）。
- 区别于纯肽载体：一些前人工作使用病毒衍生肽作为核酸载体，但纯肽往往在生物稳定性、自组装能力和体内应用方面存在局限。本文的脂肽通过引入疏水链 (C22) 实现了稳定的自组装形成纳米颗粒，提供了更好的核酸保护和体内稳定性。
软骨特异性靶向能力的集成：
- 本文将 Col2 靶向肽 WYRGRL 作为脂肽的“靶向头”，使 VPN 能够非共价结合软骨，从而提高其在关节软骨中的局部浓度和特异性。这是许多通用 LNP 或肽载体所不具备的。
ROS 响应性凝胶内纳米系统解决穿透与滞留困境：
- 区别于单一尺寸载体：前人工作要么使用小载体（易穿透但易清除），要么使用大载体（易滞留但难穿透）。本文通过设计 ROS 响应的纳米颗粒-凝胶系统 (si-VPN@HA) 巧妙地解决了这一核心矛盾。在正常生理条件下，si-VPN 被包裹在水凝胶中实现长时间滞留；在 OA 炎症微环境中，高水平的 ROS 触发水凝胶降解，释放出尺寸较小的 si-VPN-2，从而实现深度穿透软骨。这种“大尺寸滞留，小尺寸穿透”的智能切换是其显著创新。
- 区别于非响应性凝胶：传统的非响应性水凝胶在药物释放动力学上缺乏智能控制，可能导致药物过早耗尽或释放不足。ROS 响应性设计确保了药物在 OA 病灶处按需释放，提高了治疗的精准性。
协同治疗策略的探索：
- 本文进一步探索了 si-VPN@HA 与临床标准药物甲泼尼龙 (MP) 的协同作用，在 PTOA 模型中实现了比单一疗法更优越的关节保护。这种多模式协同治疗为 OA 提供了更全面的解决方案。
  
  综上所述，本研究的差异化在于其集成化的设计理念，即将病毒启发的高效转染机制、软骨靶向能力、以及针对软骨特殊生理环境的智能响应性纳米-凝胶递送系统巧妙地结合在一起，形成了一个功能强大且具有临床转化潜力的 OA 基因治疗平台。

4. 方法论

4.1. 方法原理

本研究的核心原理是设计一种多功能、模块化的病毒启发式脂肽纳米颗粒 (VPN)，并将其进一步集成到活性氧 (ROS) 响应性水凝胶中，以实现对骨关节炎 (OA) 软骨的高效、靶向核酸递送。

VPN 的设计原理：

病毒启发的高效转染：借鉴病毒的高效细胞内化和核酸释放机制，脂肽的阳离子部分被设计为富含精氨酸 (R) 和组氨酸 (H) 残基。精氨酸富集的肽段（类似细胞穿透肽 CPPs）能够促进纳米颗粒与细胞膜的相互作用并高效内吞。组氨酸的咪唑基团在 OA 病灶微酸性环境（以及内涵体/溶酶体的酸性环境）下会被质子化，引发“质子海绵效应”，导致内涵体破裂，促进核酸从溶酶体中逃逸到细胞质中，从而避免降解并提高转染效率。
软骨靶向性：脂肽的“靶向头”部分引入了 II 型胶原 (Col2) 靶向肽 WYRGRL，使纳米颗粒能够特异性地结合软骨组织，增加其在靶部位的滞留和局部浓度。
纳米结构自组装：脂肽的疏水部分（二十二烷酸， $\mathrm{C}_{22}$ ）赋予分子两亲性，使其在水溶液中能够自组装形成稳定的囊泡状或球形纳米颗粒，从而有效包裹和保护核酸货物。

ROS 响应性凝胶内纳米系统 (si-VPN@HA) 的原理：
解决软骨穿透与滞留困境：为了克服软骨递送中“小载体易穿透但易清除，大载体难穿透但易滞留”的矛盾，si-VPN 被进一步包裹在 ROS 响应性透明质酸水凝胶 (HA@gel) 中。
ROS 触发释放：OA 病灶处通常伴随炎症反应，导致活性氧 (ROS) 水平升高。HA@gel 基于 $\beta$ -环糊精 (CD) 和二茂铁 (Fc) 之间的主客体相互作用进行交联。当遇到高浓度 ROS（如 $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ ）时，二茂铁会被氧化，导致其与 $\beta$ -CD 的结合力减弱，从而触发水凝胶解聚。
按需释放与双重作用：凝胶解聚后，包裹在其中的 si-VPN-2 纳米颗粒得以释放。这些纳米颗粒尺寸较小，能够有效穿透致密的软骨基质，并被软骨细胞摄取，实现 MMP-13 的基因沉默。同时，水凝胶的包裹作用延长了 si-VPN 在关节腔内的滞留时间。

通过这些原理的结合，本研究旨在构建一个能够智能响应 OA 微环境、高效递送核酸、并兼顾软骨靶向、穿透和滞留的综合性治疗平台。

4.2. 核心方法详解 (逐层深入)

4.2.1. 脂肽的合成与表征

脂肽采用固相肽合成 (Solid-Phase Peptide Synthesis, SPPS) 协议进行生产。

固相载体：使用 Wang 树脂作为固相载体。
活化剂： $\mathrm{N},\mathrm{N}'$ -亚甲二异丙基碳二亚胺 (DIC) 和乙基氰基羟亚胺乙酸酯 (Oxyma) 作为活化剂和活化剂碱。
疏水部分偶联：在脱保护和切割之前，将二十二烷酸 ( $\mathrm{C}_{22}$ ) 偶联到肽链上。
切割与脱保护：将合成的脂肽从树脂上切割下来，并使用三氟乙酸/三异丙基硅烷/水 (95:2.5:2.5) 溶液在室温下孵育 2 小时以脱除保护基团。
纯化与表征：粗产物通过反相高效液相色谱 (HPLC) 纯化，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF mass spectrometry) 验证其分子量。

4.2.2. VPN 和 si-VPN 的构建与表征

VPN 的制备：

自组装：将 3 mg 脂肽溶解在 60 µL DMSO 中，然后缓慢加入到 2 mL DEPC 水中，搅拌 (400 g) 10 分钟后得到 VPN。
形态表征：使用透射电子显微镜 (TEM) 和场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) 评估 VPN 的形态。
pH 敏感性：将 VPN 在不同 pH 值（7.4、6.8 或 5.5）的 0.1 M PBS 中于 37 °C 孵育，通过粒度分析仪监测尺寸和 Zeta 电位的变化。

si-VPN 的制备：
微流控混合：使用微流控混合器将等体积的 VPN 溶液和 siRNA 溶液以适当浓度混合。
静电吸附：混合物通过涡旋振荡器搅拌 10 分钟，静置 2 小时，通过静电吸附形成 si-VPN。
凝聚效率评估：通过琼脂糖凝胶电泳评估最佳的 N:P (氮磷比) 值。电泳条件：100 V，60 mA。
siRNA 保护能力：si-VPN 配方与 RNase 混合酶、RNase A 和 RNase I 在 37 °C 下孵育不同时间 (0, 10, 20, 30, 60 min)。通过加入 1% SDS 使 siRNA 从 si-VPN 中解离，然后进行电泳以可视化提取的 siRNA 量。游离 siRNA 接受相同的 RNase 处理作为对照。
稳定性测试：si-VPN 在 4 °C 下于 0.1 M PBS 中孵育 48 小时，监测尺寸和 Zeta 电位。随后通过凝胶电泳评估有无 SDS 添加下的 siRNA 完整性。
元素分析：通过高角度环形暗场扫描透射电子显微镜 (HAADF-STEM) 检测 si-VPN-2 的元素分布。

MC3-LNP 的制备：
将 DLin-MC3-DMA、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2000 以 50:10:38.5:1.5 的摩尔比溶解在有机相（乙醇）中。
通过微流控混合器将有机相与含有 siRNA 或 mRNA 的醋酸缓冲液 (25 mM, pH 4.0) 以 3:1 (水:乙醇) 的流速比混合。
所得制剂通过透析纯化以去除多余的乙醇，得到 si-MC3-LNP 或 m-MC3-LNP。

4.2.3. 耗散粒子动力学模拟 (Dissipative Particle Dynamics Simulation, DPD)

粗粒化 (Coarse-Graining)：
- siRNA 分子被粗粒化为对应于磷酸基团 (P)、糖 (S) 和碱基 (A, T, C, G, U) 的珠子。
- 脂肽被粗粒化：二十二烷酸 ( $\mathrm{C}_{22}$ ) 表示为 11 个 D 珠子，肽骨架表示为 PB 珠子，侧链表示为每组 12 个珠子。
相互作用参数：使用 Materials Studio 2016 软件中的 blend 模块和 COMPASS 力场计算珠子之间的混合能量，由此推导出 DPD 相互作用参数。
模拟设置：siRNA、脂肽和水的粗粒化分子单元随机分布在模板中，以模拟介观结构的 si-VPN。
动态模拟：构建 DPD 力场，优化初始构象，进行介观动力学模拟。进行 200 ns 的长期动态模拟以分析系统的可达平衡状态和稳定性。

4.2.4. HA@gel 和 si-VPN@HA 的构建与表征

HA@gel 的构建：

共轭物合成：通过酰胺化反应将 $\beta$ -环糊精 (CD) 和二茂铁 (Fc) 分别偶联到透明质酸 (HA) 骨架上，合成 HA-CD 和 HA-Fc。
凝胶形成：等体积的 HA-CD 和 HA-Fc 以 1:1 (wt%/wt%) 的比例混合，通过 $\beta$ -CD 和 Fc 之间的主客体相互作用形成 HA 水凝胶。
流变学特性：使用旋转流变仪记录 HA@gel 在 0.1 mM 或 5.0 mM $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激下的储能模量 (G') 和损耗模量 (G'')。
自修复能力：通过循环应力 (0.2% - 400%) 测试 HA@gel 的可逆交联特性。
形态学表征：使用 SEM 观察 HA@gel 的三维网络形态。

si-VPN@HA 的制备：
将 25 µL si-VPN-2 溶液和 25 µL 10 mg/ml HA-CD 混合，得到混合物 1。
将 25 µL si-VPN-2 溶液和 25 µL 10 mg/ml HA-Fc 混合，得到混合物 2。
最后将混合物 1 和混合物 2 混合，制备 si-VPN@HA。

释放动力学：
体外释放：在含有 5 mM $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 的 PBS (pH 7.4 或 pH 6.8) 溶液中，评估 Cy5 标记的 siRNA 从 si-VPN-2、siRNA@HA (游离 siRNA 加载的 HA@gel) 和 si-VPN@HA 中的释放动力学。
荧光检测：使用荧光光谱仪在 664 nm 处检测荧光强度。
形态学变化：使用 TEM 表征在 5 mM $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激下从 si-VPN@HA 中释放的 si-VPN-2 的形态。

4.2.5. 生物安全性评估

溶血活性：使用兔红细胞评估 VPN 和 si-VPN 的溶血活性。将 4% 细胞悬浮液与不同浓度 (40-800 µg/ml) 的纳米颗粒样品在 37 °C 下孵育 1 小时，并调整 pH 值 (7.4, 6.8, 5.5)。离心后，在 570 nm 处测量上清液中的游离血红蛋白。PBS 和 $\mathrm{dH}_2\mathrm{O}$ 分别作为最小和最大溶血对照。 $\mathrm{Haemolysis\, fraction} (\%) = \frac{A_T - A_{PBS}}{A_{dH2O} - A_{PBS}} \times 100$ 其中， $A_T$ 是测试样品、 $A_{PBS}$ 是 PBS、 $A_{dH2O}$ 是 $\mathrm{dH}_2\mathrm{O}$ 的吸光度。
细胞毒性：将 ATDC5 细胞接种于 96 孔板，在达到 70%-80% 汇合度时，加入不同浓度 (基于脂肽质量) 的 VPN 和 si-VPN。培养 24 小时后，通过 MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑) 法测定细胞活力。

4.2.6. 细胞摄取与机制研究

细胞模型：使用胰岛素诱导的 ATDC5 细胞（可分化为软骨细胞，Col2α1 表达增加约 10 倍）。
时间依赖性摄取：将细胞与游离 siRNA、si-VPN-1、si-VPN-2、si-VPN-3 或 si-MC3-LNP (25 nM Cy5-siRNA) 在 1、2、4 或 8 小时孵育，通过流式细胞仪 (FACSverse) 分析。
pH 依赖性摄取：在 pH 7.4 或 pH 6.8 条件下，将细胞与 si-VPN-1、si-VPN-2、si-VPN-3 (25 nM Cy5-siRNA) 孵育 4 小时，流式细胞仪分析。
WYRGRL 靶向研究：在未诱导 ATDC5 细胞、胰岛素诱导 ATDC5 细胞和 Col2α1 siRNA 敲低 ATDC5 细胞中，孵育 si-VPNs (25 nM Cy5-siRNA)。通过流式细胞仪或Operetta CLS 高内涵分析系统成像。
细胞摄取机制：预处理胰岛素诱导 ATDC5 细胞，使用 4 °C、阿米洛利 (Amiloride, 巨胞饮抑制剂)、氯丙嗪 (Chlorpromazine, 网格蛋白介导内吞抑制剂)、菲利宾 (Filipin, 小窝蛋白介导内吞抑制剂)、Brefeldin A (BFA, 内质网-高尔基体运输抑制剂) 或 $\beta$ -CD (胆固醇螯合剂，影响小窝蛋白介导内吞)，然后与 si-VPN-2 (25 nM Cy5-siRNA) 孵育 2 小时，流式细胞仪分析。
SPR 亲和力测量：通过SPR 仪器，将 Col2 蛋白固定在 COOH 传感器芯片上，然后注入 WYRGRL 肽（或非 WYRGRL 肽）作为分析物，测量其结合动力学和解离常数 ( $K_D$ )。

4.2.7. 体外蛋白吸附评估

将 si-VPN-1、si-VPN-2 和 si-VPN-3 加入 10% 胎牛血清 (FBS) 中，在 37 °C 孵育 2 小时。
浊度测量：在 600 nm 处测量样品的吸光度。
蛋白浓度测量：离心后收集沉淀，用 Micro BCA 试剂盒测量吸附的蛋白浓度。
SDS-PAGE 分析：将样品重悬，煮沸变性蛋白，进行 SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)，后用考马斯亮蓝染色，并通过 Image J 软件半定量分析蛋白条带灰度强度。

4.2.8. 多细胞软骨球体穿透测试

软骨球体构建：将 $1 \times 10^3$ 个胰岛素诱导的 ATDC5 细胞接种到超低附着 96 孔板中，形成直径超过 200 µm 的软骨球体。
穿透测试：向每个孔中加入游离 siRNA、si-VPN-1、si-VPN-2、si-VPN-3 或 si-MC3-LNP (250 nM Cy5-siRNA)，在 pH 7.4 或 pH 6.8 条件下孵育 4、8 或 12 小时。
荧光成像：将软骨球体转移到共聚焦显微镜培养皿中，使用共聚焦激光扫描显微镜 (CLCSM) 进行 Z 堆栈扫描获取荧光图像。

4.2.9. 溶酶体共定位

ATDC5 细胞：胰岛素诱导 ATDC5 细胞与游离 siRNA、si-VPN-2 或 si-MC3-LNP (50 nM Cy5-siRNA) 孵育 2、6 或 12 小时。用 Lyso Green 染色溶酶体，Hoechst 33342 染色细胞核。使用 CLCSM 观察。
原代人软骨细胞：原代人软骨细胞与游离 siRNA、si-VPN-2 或 si-MC3-LNP (50 nM FAM-siRNA) 孵育 6 小时。用 Lyso-Tracker Red 染色溶酶体。使用 Operetta CLS 高内涵分析系统观察。
共定位分析：使用 Image Pro Plus 6.0 软件进行共定位分析，计算 Pearson's Rr 值。

4.2.10. 细胞免疫荧光染色

转染后，细胞经固定、透化、封闭。
抗体孵育：与一抗 anti-MMP-13 (ab39012, Abcam, 1/200 稀释) 孵育 2 小时，随后与 Cy5 标记的羊抗兔 IgG ( $\mathrm{H}+\mathrm{L}$ ) 二抗 (Cat. A10523, Thermo Scientific, 1/1000 稀释) 孵育 2 小时。
染色：用 DAPI 染料染色细胞核，罗丹明标记的鬼笔环肽 (rhodamine labeled phalloidine) 染色细胞骨架。
成像：使用 Operetta CLS 高内涵分析系统观察。

4.2.11. 定量 RT-PCR (RT-qPCR)

细胞模型：胰岛素诱导 ATDC5 细胞和原代人软骨细胞。
处理：ATDC5 细胞用 25 ng/ml TNFα 刺激 24 小时以模拟炎症条件。然后引入 si-VPN-1、si-VPN-2、si-VPN-3 或 si-MC3-LNP (50 nM 或 100 nM siRNA)。
RNA 提取与反转录：细胞收获后提取总 RNA，反转录为 cDNA。
qPCR 检测：使用 cDNA、引物和 SuperReal PreMix Plus 试剂盒进行 qPCR，监测 MMP-13 mRNA 的相对水平。GAPDH 作为内参。
引物序列：小鼠和人 MMP-13 siRNA 的反义序列以及引物序列详见补充表。

4.2.12. RNA-Seq 分析

处理：TNFα 激活的原代人软骨细胞用 si-VPN-2 处理 6 小时，然后培养 24 小时，以 TNFα 激活但未处理的细胞作为对照。
RNA 提取与测序：提取总 RNA，使用 Novaseq 6000 平台进行测序。
数据分析：原始数据通过 Trimmomatic 处理。差异表达基因 (Differentially Expressed Genes, DEGs) 在 P 值 $\le 0.05$ 且 Fold Change $> 2$ 或 $< 0.5$ 的条件下筛选。
生物信息学分析：进行热图和 京都基因与基因组百科全书 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG) 富集分析。

4.2.13. 离体胰蛋白酶损伤软骨外植体穿透实验

模型构建：从猪膝关节获取新鲜软骨，切成 6x1 mm 的圆柱形外植体。用 2.5% 胰蛋白酶处理 30 分钟以模拟 OA 病变。
穿透测试：向外植体加入等量 Cy5 标记 siRNA 的不同制剂 (1 µM)，包括游离 siRNA、si-VPN-1、si-VPN-2、si-VPN-3、si-MC3-LNP、si-VPN@HA 以及 si-VPN@HA + $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ (加入 5 mM $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ )，在 37 °C 下孵育 24 小时。
成像：用 VISQUE 体内 Smart-LF 系统检测外植体。随后将外植体包埋、切片 (15 µm)，用 DAPI 染色后，使用 Operetta CLS 高内涵分析系统获取荧光图像并进行定量分析。

4.2.14. 关节内滞留

动物模型：雄性 ACLT 小鼠 (术后 4 周)。
给药：对四组小鼠 (n=3) 进行关节内注射，包括游离 siRNA、si-MC3-LNP、si-VPN-2 或 si-VPN@HA，每组 Cy5 标记 siRNA 剂量相等 (0.5 mg/kg)。另外，健康小鼠也接受 si-VPN-2 关节内注射。
成像与分析：使用 VISQUE 体内 Smart-LF 系统在预定时间点获取关节荧光图像，并量化辐射效率-时间曲线和曲线下面积 (AUC)。

4.2.15. 手术诱导 ACLT 小鼠模型与体内治疗研究

模型构建：雄性 C57BL/6J 小鼠麻醉后，暴露膝关节，在 90° 屈膝状态下用微剪切断前交叉韧带 (ACL)，通过前抽屉试验确认成功。假手术 (Sham) 组仅暴露关节。
分组与治疗：术后 5 天，小鼠随机分为六组：Sham, Saline, si-MC3-LNP, si-VPN-2, si-VPN@HA, si-NEG@HA (加载随机 MMP-13 siRNA)。每组关节内注射不同制剂一次 (1 mg/kg siRNA)。
评估：
- 生物安全性：每周监测体重，4 周后收集血液进行血清生化指标检测，收集主要脏器进行 H&E 染色。
- 组织病理学：收集关节，固定、脱钙、石蜡包埋、切片 (10 µm)。用 H&E 和番红 O 染色评估整体关节组织病理学。使用 OARSI (Osteoarthritis Research Society International) 评分对关节退变进行定量评估。
- 免疫组化 (IHC)/免疫荧光 (IF)：关节切片用抗 MMP-13、抗 NGF (神经生长因子)、抗 MMP-9、抗 ADAMTS-5、抗 F4/80、抗 CD206、抗 CD80 抗体染色。
- RT-qPCR：收集关节组织（软骨和滑膜），提取总 RNA，进行 qPCR 监测 MMP-13、TNF-α、IL-1β、NF-kB1、CCL2、CXCL10、ICAM-1 和 COX-2 mRNA 水平。
- 巨噬细胞表型：通过 F4/80、CD80 (M1 巨噬细胞标志物) 和 CD206 (M2 巨噬细胞标志物) 的共免疫染色来识别滑膜巨噬细胞的表型。

4.2.16. 机械负荷 PTOA 小鼠模型与体内治疗研究

模型构建：雌性 C57BL/6J 小鼠麻醉后，将后肢固定在定制的 3D 打印固定器中。每周进行 3 次、每次 500 个循环、9.8 N 的非侵入性重复机械负荷，持续 6 周。
分组与治疗：小鼠随机分为七组：Sham (无机械负荷), Saline, si-VPN-2, si-VPN@HA, si-NEG@HA, 甲泼尼龙 (MP, 4 mg/kg), MP&si-VPN@HA (si-VPN-2 和 MP 共载于 HA@gel 中)。MP 每周给药一次，其余制剂每两周给药一次 (1 mg/kg siRNA)。
评估：
- 疼痛缓解：每周记录体重和行走速度 (cm/min)。行走分析通过开场试验 (open field test) 进行。
- 组织病理学：收集关节，进行 H&E、番红 O、MMP-13 IHC 染色。
- 微型计算机断层扫描 (Micro-CT)：对关节进行 Micro-CT 分析，评估骨赘形成、异位矿化，以及软骨下骨的形态计量学参数，包括骨体积/总体积 (BV/TV)、骨小梁数量 (Tb.N)、骨小梁厚度 (Tb.Th) 和骨小梁间距 (Tb.Sp)。
- 生物安全性：收集血液进行全血细胞计数 (CBC)。

4.2.17. mRNA 转染

m-VPNs 制备：使用微流控混合器将等体积的 VPN 溶液和 eGFP mRNA 溶液混合，制备 mRNA 凝聚的 VPN (m-VPNs)。
凝聚效率：通过琼脂糖凝胶电泳评估 mRNA 凝聚效率。
形态表征：使用 TEM 评估 m-VPN-2 的形态。
体外 mRNA 转染：胰岛素诱导 ATDC5 细胞与不同制剂 (500 ng mRNA) 孵育 6 小时，培养 24 小时后，通过流式细胞仪和 Operetta CLS 高内涵分析系统检测 eGFP 表达效率。
体内 mRNA 转染：ACL T 小鼠 (n=3) 关节内注射 m-VPN-2 或 m-MC3-LNP (10 µg mRNA/小鼠)。24 小时后收集关节，固定、脱钙、切片 (15 µm)。DAPI 染色后，使用 Operetta CLS 系统获取软骨切片中的 eGFP 荧光信号。

4.2.18. 统计分析

使用 GraphPad Prism 软件 (Version 7)。
所有定量数据表示为平均值 $\pm$ 标准差 (SD)。
两组比较采用双侧非配对 Student's t 检验。
多重比较采用非配对单向或双向方差分析 (ANOVA)。
当 $P < 0.05$ 时，差异被认为具有统计学意义。

5. 实验设置

5.1. 数据集

本研究使用了多种细胞和动物模型来全面评估其递送系统的有效性和安全性。

细胞模型：
- ATDC5 细胞系：购自 Sigma-Aldrich。这是一种小鼠软骨细胞系，经过胰岛素诱导后，能够经历软骨分化过程，使 II 型胶原 (Col2α1) 表达量增加约 10 倍，从而更好地模拟软骨细胞的生理环境。
- 患者原代软骨细胞 (Primary Human Chondrocytes)：从 3 名 OA 患者（1 男 2 女，年龄 56-83 岁，Kellgren-Lawrence 分级 4 级）接受全膝关节置换术前获取的膝关节软骨样本。这些细胞用于验证在人体细胞中的生物活性和基因沉默效果，更具临床相关性。
动物模型：
- C57BL/6J 小鼠 (8 周龄)：购自湖南 SJA 实验动物有限公司。
- 手术诱导前交叉韧带横断 (Anterior Cruciate Ligament Transection, ACLT) 模型：用于模拟 OA 损伤。通过手术切断小鼠的 ACL，导致关节不稳，进而引发 OA 进展。这是一种建立完善的 OA 模型。
- 非侵入性重复机械负荷 (Post-traumatic Osteoarthritis, PTOA) 模型：通过对小鼠膝关节施加重复的非侵入性机械负荷 (9.8 N，500 次循环，每周 3 次，持续 6 周) 来诱导创伤后 OA。这种模型能够模拟创伤性损伤后 OA 进展的力学因素。
  
  数据集中的具体样本示例：原文未直接提供数据集中具体样本的图片示例，但通过对细胞和动物模型的描述，可以理解数据的基本形态：
细胞层面：ATDC5 细胞和原代人软骨细胞在培养皿中生长，接受不同纳米颗粒处理，随后通过流式细胞术检测荧光强度（如 Cy5-siRNA 摄取量），通过共聚焦显微镜观察细胞内荧光分布（如 siRNA 与溶酶体共定位），或通过免疫荧光/RT-qPCR 检测基因/蛋白表达（如 MMP-13）。
动物层面：小鼠膝关节是主要研究对象，通过 H&E 和番红 O 染色观察软骨组织形态、蛋白聚糖含量；通过免疫组化/免疫荧光检测特定蛋白（如 MMP-13, NGF）的表达；通过 Micro-CT 观察骨赘形成和软骨下骨微结构；通过 IVIS 活体成像系统监测关节内荧光信号（纳米颗粒滞留）。

为什么选择这些数据集进行实验？ 这些数据集的选择是具有策略性的，旨在从多个层面验证研究方法的有效性和转化潜力：

ATDC5 细胞：作为一种易于培养和诱导分化的软骨细胞系，是初步体外筛选载体性能（细胞毒性、摄取、转染效率）的理想模型。
患者原代软骨细胞：直接来源于 OA 患者，其生理病理状态更接近临床情况，能够更好地验证所开发载体在人体细胞中的治疗潜力，增加研究的临床相关性。
ACLT 小鼠模型：是一种经典的、公认的手术诱导 OA 模型，能够模拟关节损伤后 OA 的进展，用于评估载体在体内减轻软骨退变、抗炎和止痛的效果。
PTOA 小鼠模型：通过非侵入性机械负荷模拟创伤后 OA 的发生，对于评估载体在力学损伤诱导的 OA 中的保护作用具有重要意义，并且允许与临床标准治疗（如甲泼尼龙）进行协同作用的探索。

这些数据集能够全面有效地验证方法从体外到体内的各个环节的性能，涵盖了细胞、组织和整体动物水平，有助于评估所开发载体在 OA 治疗中的潜力。

5.2. 评估指标

本研究采用了多种体外和体内评估指标，以全面衡量所开发纳米递送系统的性能、生物安全性和治疗效果。

5.2.1. 溶血活性 (Hemolytic Activity)

概念定义：溶血活性是评估生物材料血液相容性的重要指标，反映材料对红细胞膜的破坏程度。高溶血活性可能导致红细胞裂解，释放血红蛋白，具有潜在的毒性。
数学公式： $\mathrm{Haemolysis\, fraction} (\%) = \frac{A_T - A_{PBS}}{A_{dH2O} - A_{PBS}} \times 100$
符号解释：
- $\mathrm{Haemolysis\, fraction} (\%)$ ：溶血百分比。
- $A_T$ ：测试样品（纳米颗粒溶液）处理后的上清液在 570 nm 处的吸光度。
- $A_{PBS}$ ：PBS (生理盐水) 处理后的上清液在 570 nm 处的吸光度，代表最小溶血（背景值）。
- $A_{dH2O}$ ：蒸馏水 ( $\mathrm{dH}_2\mathrm{O}$ ) 处理后的上清液在 570 nm 处的吸光度，代表最大溶血（100% 溶血）。

5.2.2. 细胞毒性 (Cytotoxicity)

概念定义：评估纳米颗粒对细胞生存能力的影响。通过测定细胞的半数抑制浓度 ( $\mathrm{IC}_{50}$ ) 来量化毒性，即导致 50% 细胞死亡的药物浓度。
数学公式：通常通过 MTT 实验（或类似代谢活性测定）获得细胞存活率曲线，然后通过剂量-反应曲线拟合计算 $\mathrm{IC}_{50}$ 值。具体的计算公式依赖于拟合模型，通常为四参数或五参数逻辑回归。 $\mathrm{Cell\, viability} (\%) = \frac{\mathrm{Absorbance}_{sample} - \mathrm{Absorbance}_{blank}}{\mathrm{Absorbance}_{control} - \mathrm{Absorbance}_{blank}} \times 100$
符号解释：
- $\mathrm{Cell\, viability} (\%)$ ：细胞存活率百分比。
- $\mathrm{Absorbance}_{sample}$ ：样品处理组的吸光度（570 nm）。
- $\mathrm{Absorbance}_{blank}$ ：空白组（无细胞无样品）的吸光度。
- $\mathrm{Absorbance}_{control}$ ：未处理对照组（正常细胞）的吸光度。

5.2.3. 细胞摄取 (Cellular Uptake)

概念定义：衡量纳米颗粒进入细胞内部的效率。通常通过荧光标记的核酸或载体，利用流式细胞术或荧光显微镜来定量或定性评估。
数学公式：流式细胞术通常报告平均荧光强度 (Mean Fluorescence Intensity, MFI) 或荧光阳性细胞百分比。 $\mathrm{MFI} = \frac{\sum_{i=1}^{N} \mathrm{Fluorescence}_{i}}{N}$
符号解释：
- $\mathrm{MFI}$ ：平均荧光强度。
- $\mathrm{Fluorescence}_{i}$ ：第 $i$ 个细胞的荧光强度。
- $N$ ：分析的细胞总数。

5.2.4. 表面等离子共振 (Surface Plasmon Resonance, SPR)

概念定义：用于实时监测生物分子间相互作用（如结合亲和力、结合/解离速率）。通过测量 SPR 信号变化，可以量化靶向肽与靶分子（如 Col2）的结合强度。
数学公式：通过拟合传感器图（响应单位 (RU) 对时间）来计算结合动力学参数（结合速率常数 $k_a$ 、解离速率常数 $k_d$ ）和平衡解离常数 ( $K_D$ )。 $K_D = \frac{k_d}{k_a}$
符号解释：
- $K_D$ ：平衡解离常数，表示分子间亲和力的强弱，值越小亲和力越强。
- $k_d$ ：解离速率常数。
- $k_a$ ：结合速率常数。

5.2.5. RNAi 效率 (RNAi Efficacy)

概念定义：衡量 siRNA 载体通过 RNA 干扰机制沉默靶基因（如 MMP-13）表达的效率。
数学公式：通常通过 RT-qPCR 测量靶基因 mRNA 表达水平的相对降低。 $\mathrm{mRNA\, expression\, reduction} (\%) = \left(1 - \frac{\mathrm{Target\, gene\, mRNA}_{treated}}{\mathrm{Target\, gene\, mRNA}_{control}}\right) \times 100$ RT-qPCR 计算相对表达量常用 $2^{-\Delta\Delta C_T}$ 方法： $\mathrm{Relative\, expression} = 2^{-(\Delta C_{T, sample} - \Delta C_{T, calibrator})} = 2^{-\Delta\Delta C_T}$ 其中， $\Delta C_T = C_{T, target} - C_{T, reference}$ 。
符号解释：
- $\mathrm{Target\, gene\, mRNA}_{treated}$ ：处理组靶基因 mRNA 的表达水平。
- $\mathrm{Target\, gene\, mRNA}_{control}$ ：对照组靶基因 mRNA 的表达水平。
- $C_{T, target}$ ：靶基因的循环阈值 (Cycle Threshold)。
- $C_{T, reference}$ ：内参基因的循环阈值。
- $\Delta C_{T, sample}$ ：样品组的 $\Delta C_T$ 值。
- $\Delta C_{T, calibrator}$ ：校准（对照）组的 $\Delta C_T$ 值。

5.2.6. OARSI 评分 (OARSI Histopathology Initiative Score)

概念定义：骨关节炎研究协会国际 (OARSI) 评分是一种标准化的、半定量的组织病理学评分系统，用于评估关节软骨损伤的严重程度和进展，包括软骨表面完整性、裂隙深度、细胞丢失、蛋白聚糖耗竭等。评分越高，损伤越严重。
数学公式：OARSI 评分通常通过对不同区域（如内侧胫骨、内侧股骨）的软骨损伤程度进行分级（0-6 级），然后进行加权或求和。具体评分细则较为复杂，取决于评估部位和软骨层深度。 $\mathrm{OARSI\, Score} = \sum_{i=1}^{N} \mathrm{Severity\, Score}_{i} \times \mathrm{Weighting\, Factor}_{i}$
符号解释：
- $\mathrm{OARSI\, Score}$ ：总 OARSI 评分。
- $\mathrm{Severity\, Score}_{i}$ ：第 $i$ 个区域或特征的损伤严重程度评分。
- $\mathrm{Weighting\, Factor}_{i}$ ：第 $i$ 个区域或特征的权重因子。
- $N$ ：评估的区域或特征数量。

5.2.7. 微型计算机断层扫描 (Micro-CT) 参数

概念定义：Micro-CT 用于高分辨率分析骨骼的微结构特征，评估骨赘形成和软骨下骨的健康状况。
数学公式：
1. 骨体积/总体积 (Bone Volume/Total Volume, BV/TV)：骨小梁骨量最常用的指标，反映骨组织的密度。 $\mathrm{BV/TV} = \frac{\mathrm{Volume\, of\, bone}}{\mathrm{Total\, volume\, of\, region\, of\, interest}}$
2. 骨小梁数量 (Trabecular Number, Tb.N)：单位长度内的骨小梁数量，反映骨小梁网络的连接性。
3. 骨小梁厚度 (Trabecular Thickness, Tb.Th)：骨小梁的平均厚度。
4. 骨小梁间距 (Trabecular Separation, Tb.Sp)：骨小梁之间的平均距离。
符号解释：
- $\mathrm{BV/TV}$ ：骨体积与总体积之比。
- $\mathrm{Volume\, of\, bone}$ ：感兴趣区域内骨组织的体积。
- $\mathrm{Total\, volume\, of\, region\, of\, interest}$ ：感兴趣区域的总体积。
- $\mathrm{Tb.N}$ ：骨小梁数量，单位通常为 $\mathrm{mm}^{-1}$ 。
- $\mathrm{Tb.Th}$ ：骨小梁厚度，单位通常为 µm。
- $\mathrm{Tb.Sp}$ ：骨小梁间距，单位通常为 µm。

5.2.8. 曲线下面积 (Area Under Curve, AUC)

概念定义：在药代动力学和生物信号分析中，AUC 用于量化一段时间内药物浓度或信号强度对时间的累积暴露量。在本文中，用于衡量关节内荧光信号随时间的累积滞留量，AUC 越大表示滞留时间越长或信号越强。
数学公式：AUC 通常通过梯形法则 (Trapezoidal Rule) 对时间-信号强度曲线进行数值积分。 $\mathrm{AUC} = \sum_{i=1}^{N-1} \frac{(\mathrm{Signal}_{i} + \mathrm{Signal}_{i+1})}{2} \times (\mathrm{Time}_{i+1} - \mathrm{Time}_{i})$
符号解释：
- $\mathrm{AUC}$ ：曲线下面积。
- $\mathrm{Signal}_{i}$ ：在时间点 $\mathrm{Time}_{i}$ 的信号强度（如荧光辐射效率）。
- $\mathrm{Time}_{i}$ ：第 $i$ 个时间点。
- $N$ ：时间点总数。

5.2.9. 步行速度 (Walking Speed)

概念定义：衡量小鼠关节运动功能的直接指标。在 OA 疼痛或关节功能受损时，小鼠的步行速度通常会降低。
数学公式： $\mathrm{Walking\, Speed} = \frac{\mathrm{Total\, moving\, distance}}{\mathrm{Total\, moving\, time}}$
符号解释：
- $\mathrm{Walking\, Speed}$ ：步行速度，单位通常为 cm/min。
- $\mathrm{Total\, moving\, distance}$ ：小鼠在规定时间内移动的总距离。
- $\mathrm{Total\, moving\, time}$ ：小鼠移动的总时间。

5.3. 对比基线

本研究将自己提出的方法与以下基线模型进行了比较，以全面评估其性能优势：

生理盐水 (Saline)：作为阴性对照组，用于观察疾病的自然进展，并与治疗组进行比较以评估治疗效果。
siRNA 加载的常规脂质纳米颗粒 (si-MC3-LNP)：
- 组成：由 DLin-MC3-DMA (一种商业化的可电离脂质)、DSPC、胆固醇和 DMG-PEG2000 以特定摩尔比 (50:10:38.5:1.5) 组成。
- 代表性：MC3-LNP 是目前临床上已广泛应用且成功的 LNP 平台（例如用于 siRNA 肝脏递送和 mRNA 疫苗），因此是评估新型递送载体转染效率和体内效果的重要基线。它代表了当前非病毒核酸递送的“黄金标准”，但其在肝外组织（如软骨）的应用仍面临挑战。
加载随机 MMP-13 siRNA 的 HA 水凝胶 (si-NEG@HA)：
- 组成：HA@gel 包裹的是与 MMP-13 无效结合的随机序列 siRNA (si-NEG)。
- 代表性：该基线用于区分 si-VPN@HA 的治疗效果是来源于 siRNA 的特异性沉默作用，还是仅仅来源于 HA 水凝胶本身的非特异性效应或物理屏障作用。
甲泼尼龙 (Methylprednisolone, MP)：
- 组成：一种临床上常用的糖皮质激素。
- 代表性：MP 是目前骨关节炎临床干预中最普遍的关节内注射皮质类固醇之一，主要用于减轻炎症和疼痛。它作为一种已上市的临床标准药物，是评估新型疗法在 OA 治疗中（特别是疼痛缓解和抗炎方面）有效性的重要阳性对照和协同治疗的潜在伙伴。
  
  这些基线的选择具有代表性，涵盖了疾病进展对照、现有主流非病毒递送技术对照、载体系统非特异性效应对照以及临床标准药物对照，使得本研究的结论更具说服力。

6. 实验结果与分析

6.1. 核心结果分析

本研究通过一系列体外和体内实验，全面评估了病毒启发脂肽纳米颗粒 (VPN) 及其凝胶内系统 (si-VPN@HA) 在骨关节炎 (OA) 治疗中的核酸递送效率和治疗潜力。

6.1.1. VPN 和 si-VPN 的构建与表征

脂肽设计与自组装：研究者模块化设计了多功能脂肽，包含 Col2 靶向头 WYRGRL、可变精氨酸和组氨酸阳离子部分以及疏水 C22 尾巴。脂肽 1-9（含 C22 尾巴）能自组装形成 VPN。VPN-1 和 VPN-2 尺寸约为 50 nm，VPN-3 尺寸稍大（约 90 nm），均带正电荷。
pH 敏感性：VPN 在酸性环境（pH 6.8 和 5.5）下，其 Zeta 电位和尺寸相对于 pH 7.4 均逐渐增加，表明其具有 pH 敏感性，这对于在 OA 炎症微环境（微酸性）和溶酶体中的功能至关重要。
siRNA 包裹与保护：si-VPN (siRNA 加载的 VPN) 通过微流控技术制备，siRNA 凝聚效率高（si-VPN-2 和 si-VPN-3 的 N:P 比为 6:1），且能有效保护 siRNA 免受 RNase 降解。包裹 siRNA 后，si-VPN 的尺寸略有增大，但表面电荷显著降低。
形态转变：VPN 呈现明确的单层囊泡结构，而 si-VPN 在包裹 siRNA 后转变为固态球形纳米颗粒，类似于脂质体转变为 LNP 的结构变化。DPD 模拟进一步验证了 si-VPN 具有固态球形结构，siRNA 和脂肽复合物集中在核心，外层由肽骨架和亲水基团组成，且在 200 ns 模拟中保持稳定。

6.1.2. si-VPNs 的体外生物学评估与基因沉默效能

生物安全性：si-VPNs 的细胞毒性显著低于游离 VPN， $\mathrm{IC}_{50}$ 值高出 10 倍以上（例如 si-VPN-2 的 $\mathrm{IC}_{50}$ 为 4701 µg/mL），且在 300 µg/mL 以下的浓度溶血率不超过 5%，表明其具有良好的细胞相容性。
细胞摄取：si-VPNs 在胰岛素诱导的 ATDC5 细胞中显示出比 si-MC3-LNP 更高的细胞摄取量，其中 si-VPN-2 表现出最高的平均荧光强度 (MFI)。WYRGRL 靶向头显著增强了 si-VPNs 的细胞摄取，且在酸性环境 (pH 6.8) 下，si-VPNs 的细胞摄取量增加约 2 倍。机制研究表明，si-VPN-2 的内化是能量依赖的，主要通过巨胞饮和网格蛋白介导的内吞作用。
软骨穿透：si-VPN-2 在 3D 软骨细胞球体模型中显示出优异的穿透能力，能够深入球体中心，且在酸性条件 (pH 6.8) 下穿透能力显著增强。si-VPN-3 则主要滞留在球体外层。
溶酶体逃逸：si-VPN-2 能够快速有效地从溶酶体中逃逸到细胞质中（12 小时后 Pearson's Rr 值降至约 0.2），而 si-MC3-LNP 在 6-12 小时仍被困在溶酶体中。这归因于 VPN-2 中聚组氨酸的质子海绵效应。
基因沉默：在 TNFα 刺激的 ATDC5 细胞中，si-VPN-2 显示出最有效的 MMP-13 基因沉默能力，在 100 nM siRNA 剂量下，MMP-13 敲低率超过 85%，远优于 si-MC3-LNP。

6.1.3. MMP-13 沉默对基因表达谱的广泛影响

原代软骨细胞验证：在患者原代软骨细胞中，si-VPN-2 同样表现出最高的细胞摄取量（比 si-MC3-LNP 高 3.04 倍）和优异的溶酶体逃逸能力。si-VPN-3 因高程度非特异性蛋白吸附而形成明显聚集体。
MMP-13 沉默效应：si-VPN-2 显著降低了原代软骨细胞中 MMP-13 mRNA 和蛋白表达，效果甚至与未受 TNFα 刺激的对照组相当。
RNA-Seq 分析：si-VPN-2 治疗显著下调了 329 个基因，上调了 519 个基因。下调基因包括趋化因子 (CCL2, CCL7, CXCL6, CXCL10)、免疫相关标志物 (TLR2)、促炎标志物 (IL34, ICAM-1, NFkB2)、软骨基质负调节因子 (ADAMTS12) 和促凋亡基因 (TP53)。上调基因包括抗炎标志物 (IL11, IL33) 和软骨细胞分化相关基因 (GDF5, BMP6)。KEGG 富集分析显示， si-VPN-2 治疗显著影响了与 OA 发病机制相关的重要信号通路，如 TNF、细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt 和 MAPK 通路。

6.1.4. 凝胶内纳米系统 (si-VPN@HA) 的构建与释放动力学

HA@gel 特性：基于 $\beta$ -CD 和 Fc 的主客体识别构建的 ROS 响应性 HA@gel，在 5 mM $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激下，表现出快速的凝胶-溶胶转变和显著降低的储能模量，且具有潜在的自修复能力。
si-VPN@HA 释放：荧光扫描和时间分辨释放曲线表明，siRNA 在 si-VPN@HA 中保持包裹状态，仅在 ROS 触发凝胶溶解时释放出完整的 si-VPN-2 纳米颗粒，而非游离 siRNA。释放的 si-VPN-2 仍保持单分散球形。
软骨穿透与关节内滞留：
- 离体软骨穿透实验显示，si-VPN-2 具有最佳的穿透能力，而 si-VPN@HA 在无 $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 时穿透力低，但在 $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激下荧光信号显著增加（约 2-3 倍），表明其 ROS 响应性释放提高了穿透效率。
- 体内关节内滞留实验表明，si-VPN@HA 具有最佳的关节内滞留性能，荧光信号可持续超过 21 天，AUC 比 si-VPN-2 和 si-MC3-LNP 分别高出 2.31 和 3.41 倍。si-VPN-2 在 OA 关节中的滞留也优于健康关节。

6.1.5. si-VPN@HA 在手术诱导 ACLT 模型中缓解软骨退变

组织病理学：si-VPN@HA 治疗组的 OARSI 评分显著低于 si-VPN-2 或 si-MC3-LNP 组，与 Sham 组无统计学差异，表现出良好的关节结构保护和最小的软骨损伤。
MMP-13 沉默：si-VPN@HA 使软骨和半月板中的 MMP-13 表达降低超过 75%，是所有治疗组中最低的。
疼痛缓解：si-VPN@HA 显著降低滑膜中神经生长因子 (NGF) 表达近 80%，表明其能有效缓解疼痛。
其他 catabolic 酶抑制：si-VPN@HA 还显著下调了 MMP-9 和 ADAMTS-5 的表达，这些是软骨细胞分解代谢的标志物。
巨噬细胞极化调节：si-VPN@HA 显著增加了滑膜 M2 巨噬细胞 ( $\mathrm{CD}206^+\mathrm{F4/80}^+$ ) 的丰度（比 si-MC3-LNP 高 3.51 倍），同时降低了 M1 巨噬细胞 ( $\mathrm{CD}80^+\mathrm{F4/80}^+$ ) 的丰度，表明其具有抗炎作用。
炎症相关基因表达：si-VPN@HA 显著降低了 TNF-α、IL-1β、NF-kB1、CCL2、CXCL10、ICAM-1 和 COX-2 等炎症相关基因的 mRNA 水平。

6.1.6. 与类固醇治疗协同在 PTOA 模型中实现卓越关节保护

行走速度：MP&si-VPN@HA 组小鼠的行走速度保持最佳（6 周后为 606.2 cm/min），显著高于 si-VPN-2 组（292.6 cm/min）和 si-VPN@HA 组（475 cm/min），表明其对关节功能的良好保护。
组织病理学：MP&si-VPN@HA 组的 OARSI 评分显著低于 MP 单药组和 si-VPN@HA 单药组，显示出更优异的关节软骨保护。MMP-13 表达在关节软骨和半月板中也降至最低。
骨赘形成与软骨下骨保护：Micro-CT 结果显示，MP&si-VPN@HA 显著抑制了骨赘形成（比 Saline 组降低约 90%）和异位矿化，并有效保护了软骨下骨微结构，表现出更好的 BV/TV、Tb.N 和 Tb.Th，同时降低了 Tb.Sp。

6.1.7. VPN-2 实现关节内 mRNA 递送

m-VPNs 制备：m-VPN-2 在 N:P 比 $\ge 2.304$ 时可完全凝聚 mRNA。加载 mRNA 后，m-VPN-2 也从囊泡结构转变为固态球形纳米颗粒。
eGFP 表达：在 ATDC5 细胞中，m-VPN-2 组的 eGFP 阳性细胞比例高达 59.98%，比 mRNA 加载的 MC3-LNP (m-MC3-LNP) 高 3.95 倍，MFI 也显著提高。
体内 mRNA 递送：在 ACLT 小鼠中，m-VPN-2 组软骨切片中的 eGFP 荧光强度比 m-MC3-LNP 组高 4.30 倍，表明其在关节内 mRNA 递送方面的优越性。

总的来说，这些结果强有力地验证了 VPN 平台作为一种高效、靶向、ROS 响应的核酸（包括 siRNA 和 mRNA）递送载体，在 OA 治疗中具有显著的治疗潜力，特别是在软骨保护、抗炎和疼痛缓解方面。si-VPN@HA 成功解决了软骨递送中的穿透与滞留困境，并通过与临床药物协同作用，实现了更全面的关节保护。

6.2. 数据呈现 (表格)

原文未提供表格结果，所有结果均以文本、图表和图片形式呈现。

6.3. 消融实验/参数分析

本研究通过比较不同脂肽结构和递送形式，进行了间接的“消融实验”和参数分析，以验证各模块的功能和优化递送系统。

6.3.1. 脂肽阳离子部分结构对性能的影响 (VPN-1, VPN-2, VPN-3 比较)

设计差异：
- VPN-1： $-(\mathrm{R})_5-(\mathrm{H})_4-$
- VPN-2： $-[(\mathrm{R})_5-(\mathrm{H})_4]_2-$ (即重复一次 VPN-1 的阳离子序列)
- VPN-3： $-(\mathrm{R})_{10}-(\mathrm{H})_8-$ (与 VPN-2 具有相同数量的精氨酸和组氨酸残基，但排列方式不同)
结果分析：
- 细胞摄取：si-VPN-2 始终表现出最高的细胞摄取量 (MFI)，优于 si-VPN-1 和 si-VPN-3，以及 si-MC3-LNP (图 2A)。这表明阳离子部分的特定重复序列 $-[(\mathrm{R})_5-(\mathrm{H})_4]_2-$ 在促进细胞内化方面具有最佳构象或电荷分布。
- 软骨穿透：si-VPN-2 在 3D 软骨细胞球体模型中具有最佳的深层穿透能力。si-VPN-3 则主要滞留在外层 (图 2F)。这可能是因为 VPN-3 的直链结构 $-(\mathrm{R})_{10}-(\mathrm{H})_8-$ 导致了高程度的非特异性蛋白吸附（如在 FBS 中表现出更高的浊度和蛋白吸附量），进而影响了其穿透能力。
- 基因沉默：si-VPN-2 表现出最有效的 MMP-13 基因沉默效率 (图 2H)。
- 蛋白吸附：si-VPN-3 在 10% FBS 中显示出比 si-VPN-2 显著更高的浊度和蛋白吸附量，SDS-PAGE 也显示 si-VPN-3 具有更多且灰度更深的蛋白条带，验证了其高程度非特异性蛋白吸附的假设。这解释了 si-VPN-3 尽管与 si-VPN-2 拥有相同数量的精氨酸和组氨酸，但性能较差的原因。
结论：VPN-2 中阳离子部分的重复序列 $-[(\mathrm{R})_5-(\mathrm{H})_4]_2-$ 是最佳的，因为它在平衡核酸凝聚、细胞摄取、溶酶体逃逸和避免非特异性蛋白吸附方面达到了最优。

6.3.2. WYRGRL 靶向头的作用

设计差异：比较含有 WYRGRL 靶向头的 si-VPNs 与非修饰对照。
结果分析：WYRGRL 修饰的 si-VPNs 表现出显著更高的细胞摄取 MFI (图 2B)。SPR 实验证实了 WYRGRL 肽与 Col2 之间存在高亲和力 (KD 为 $2.05 \times 10^{-8}$ M)，而非修饰肽无此结合 (图 2C)。此外，在胰岛素诱导的 ATDC5 细胞（Col2 表达高）中的摄取量高于未诱导细胞和 Col2α1 敲低细胞 (图 S19A-B)，进一步证实了 WYRGRL 的 Col2 依赖性靶向能力。
结论：WYRGRL 靶向头有效赋予了 si-VPNs 软骨特异性结合和增强细胞摄取的能力。

6.3.3. pH 敏感性的作用

设计原理：脂肽中的组氨酸残基赋予 VPN pH 敏感性。
结果分析：
- Zeta 电位和尺寸：VPN 在 pH 6.8 和 5.5 条件下，Zeta 电位和尺寸均高于 pH 7.4 (图 1B)。
- 细胞摄取：在 pH 6.8 条件下，si-VPNs 的细胞摄取量比 pH 7.4 增加约 2 倍 (图 2D)。
- 软骨穿透：si-VPN-2 在 pH 6.8 下的穿透深度显著高于 pH 7.4 (图 2F)。
- 溶酶体逃逸：溶酶体共定位实验显示 si-VPN-2 能够高效溶酶体逃逸 (图 2G)。
结论：VPN 的 pH 敏感性使其能够在 OA 炎症微环境（微酸性）和内涵体/溶酶体酸性环境中增强内吞、促进软骨穿透并高效溶酶体逃逸，从而提高转染效率。

6.3.4. ROS 响应性凝胶内纳米系统 (si-VPN@HA) 的作用

设计差异：比较 si-VPN-2 (游离纳米颗粒) 与 si-VPN@HA (凝胶内系统)。
结果分析：
- 关节内滞留：si-VPN@HA 显著延长了关节内滞留时间（超过 21 天），远优于游离 si-VPN-2 和 si-MC3-LNP (图 4I-K)。
- 软骨穿透：si-VPN@HA 在无 $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激时穿透力较低，但在 $\mathrm{H}_2\mathrm{O}_2$ 刺激下，荧光信号在软骨外植体和切片中显著增加 (约 2-3 倍)，表明凝胶解聚后释放的 si-VPN-2 仍保留了良好的穿透能力 (图 4F-H)。
- 治疗效果：在 ACLT 小鼠模型中，si-VPN@HA 的 OARSI 评分显著低于 si-VPN-2，且在 MMP-13 沉默、抗炎和止痛效果上表现更优 (图 5C, E)。
结论：si-VPN@HA 成功解决了软骨递送中穿透与滞留的困境，实现了在关节腔内的长效滞留，并在病灶处 ROS 刺激下按需释放纳米颗粒以实现深层穿透和高效治疗。

通过这些细致的比较和功能验证，研究者不仅证明了其创新递送平台在各个模块上的有效性，还系统地阐明了各组分对整体性能的贡献。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究成功开发了一种新型的病毒启发式脂肽纳米颗粒 (VPN) 平台，用于骨关节炎 (OA) 的软骨靶向核酸递送。该平台通过模块化设计，结合了 II 型胶原 (Col2) 靶向肽 WYRGRL、富含精氨酸和组氨酸的阳离子肽段以及疏水脂质部分。优化后的 VPN-2 结构（阳离子部分为 $- [ ( { \bf R } ) _ { 5 } - ( { \bf H } ) _ { 4 } ] _ { 2 } .$ ）在体外表现出卓越的细胞内吞、溶酶体逃逸和基因沉默效率，比传统脂质纳米颗粒 (LNP) 高出约 2.5 倍，能够高效沉默 MMP-13 基因表达。

为了克服关节软骨递送中穿透与滞留的矛盾，研究者进一步将 si-VPN-2 包裹在 ROS 响应性透明质酸水凝胶 (HA@gel) 中，形成了 si-VPN@HA 凝胶内纳米系统。该系统在关节腔内具有显著的长期滞留能力（超过 21 天），并在 OA 炎症微环境高 ROS 刺激下可智能解聚，释放出具有良好软骨穿透力的 si-VPN-2。

体内研究结果令人鼓舞：

在手术诱导的 ACLT 小鼠模型中，si-VPN@HA 显著减轻了软骨退变，有效沉默了 MMP-13 表达（约 75% 敲低），降低了炎症反应（如调节巨噬细胞极化），并缓解了疼痛。
在创伤后骨关节炎 (PTOA) 小鼠模型中，与临床标准糖皮质激素甲泼尼龙 (MP) 联用时，MP&si-VPN@HA 表现出卓越的协同关节保护作用，有效抑制了骨赘形成和异位矿化，改善了软骨下骨微结构，并维持了关节功能。
此外，研究还初步验证了 VPN-2 作为关节内 mRNA 递送载体的潜力，实现了比 LNP 更高的 eGFP mRNA 表达效率。

综上所述，本研究为 OA 治疗提供了一个创新且高效的软骨靶向核酸递送平台，其智能响应性和协同治疗潜力预示着未来 OA 疗法的新方向。

7.2. 局限性与未来工作

论文作者指出了该研究的初步性质，并暗示了未来需要进一步探索的方向。结合研究内容，可以总结出以下局限性和未来工作：

7.2.1. 局限性

动物模型与人类 OA 的差异：尽管使用了两种 OA 小鼠模型，但动物模型与人类 OA 的病理复杂性、疾病进展和响应机制仍存在差异。例如，小鼠的关节尺寸、代谢速率和免疫反应与人类不同，这可能影响递送系统的药代动力学和疗效。
长期生物安全性评估：虽然初步的体外和短期体内研究显示了良好的生物相容性，但对于长期（例如数月或数年）关节内给药的潜在免疫原性、毒性累积或组织反应，还需要进行更深入和长期的评估。特别是脂肽和水凝胶降解产物的长期安全性。
载体的稳定性与免疫原性：纳米颗粒在复杂的生物流体（如滑液）中可能面临蛋白冠形成、聚集、降解等问题，影响其稳定性和生物分布。尽管初步评估了蛋白吸附，但全面评估其在体内复杂环境中的长期稳定性、以及可能诱导的免疫反应（即使是低免疫原性）仍是挑战。
脂肽的规模化生产：脂肽的固相合成（SPPS）在实验室规模可行，但大规模生产的成本和效率可能成为未来临床转化的挑战。
mRNA 递送的全面性：虽然初步验证了 eGFP mRNA 的递送，但对于具有治疗作用的 mRNA（如编码软骨修复蛋白或抗炎因子）的递送效率、蛋白质表达量和功能持续时间等，还需要进行详细研究。
协同机制的深入阐明：论文揭示了 si-VPN@HA 与甲泼尼龙的协同作用，但对于这种协同作用背后的分子机制（例如它们在细胞通路上的精确交叉点、药物代谢的影响等），还需要更深入的探究。

7.2.2. 未来工作

进一步优化脂肽结构和凝胶系统：
- 探索不同肽序列、脂质部分或交联剂，以进一步提高核酸凝聚效率、细胞靶向性、溶酶体逃逸能力和 ROS 响应性。
- 优化凝胶的降解动力学和力学性能，以更好地匹配 OA 关节的生理环境。
探索更多核酸药物：
- 除了 MMP-13 siRNA，可以探索递送其他与 OA 相关的 siRNA 靶点（如炎症因子、凋亡基因）或治疗性 mRNA（如编码生长因子、抗炎蛋白、软骨细胞分化因子）。
- 研究递送 miRNA、saRNA 等其他类型的核酸药物。
更大规模、更长期的临床前研究：
- 在更大的动物模型（如兔、猪或绵羊）中进行更长期的研究，以更好地模拟人类 OA，评估长期疗效和安全性。
- 进行重复给药研究，评估其在慢性疾病管理中的潜力。
深入研究免疫调节机制：
- 进一步阐明 si-VPN@HA 如何调节滑膜巨噬细胞极化，以及其对关节局部微环境中的其他免疫细胞（如 T 细胞、B 细胞）的影响。
- 评估载体本身可能引起的免疫原性，并设计策略加以规避。
临床转化前的工程化和规范化：
- 优化生产工艺，确保批次间一致性和可重复性。
- 进行详细的药代动力学 (PK) 和药效学 (PD) 研究，包括药物在关节内的分布、停留时间、细胞摄取效率等。
- 进行更全面的毒理学评估，以满足监管机构的要求。

7.3. 个人启发与批判

7.3.1. 个人启发

多功能模块化设计理念：本研究最显著的启发之一是其多功能模块化设计。通过将靶向、核酸凝聚、溶酶体逃逸和环境响应性等功能集成到单一脂肽分子和纳米-凝胶系统中，实现了对复杂生物屏障和微环境的智能应对。这种自下而上、功能导向的设计策略，在开发新型药物递送系统方面具有普遍指导意义。
“病毒启发”的价值：研究者从病毒的高度进化性中汲取灵感，利用病毒的高效细胞感染和核酸释放机制（如 CPPs 和 pH 响应性），巧妙地设计出非致病性载体。这提醒我们，自然界是工程设计的宝库，对生物系统进行深入理解并加以模仿是创新研究的重要途径。
解决“穿透与滞留”两难的智能策略：针对软骨组织特有的挑战，si-VPN@HA 系统通过“大载体滞留、小载体穿透”的动态切换机制，为其他需要克服类似生物屏障（如肿瘤微环境、脑血屏障）的药物递送难题提供了范例。智能响应性材料在精准医学中的潜力巨大。
协同治疗的潜力：si-VPN@HA 与甲泼尼龙的协同作用，揭示了将基因疗法与传统药物结合的巨大潜力。这种“组合拳”策略可能比单一疗法产生更优异的治疗效果，并可能降低单一药物的剂量或副作用。

7.3.2. 批判

MMP-13 靶向的特异性与全身效应：虽然 MMP-13 被认为是 OA 的关键驱动因子，但其在其他生理过程中也可能发挥作用。尽管 siRNA 递送是局部的，并且理论上可以避免小分子抑制剂的全身副作用，但仍需更全面地评估局部 MMP-13 沉默的潜在脱靶效应或对软骨修复过程的长期影响。
ROS 响应性的可控性与个体差异：ROS 响应性水凝胶的降解速率取决于局部 ROS 浓度，而 OA 患者的 ROS 水平存在个体差异和病程动态变化。这可能导致药物释放速率的不一致性，影响治疗效果。未来的研究可能需要探索更精确、更个性化的响应机制或释放调控。
si-VPN-3 非特异性蛋白吸附的机制：论文提及 si-VPN-3 因高程度非特异性蛋白吸附而性能不佳，并初步通过浊度和 SDS-PAGE 验证。进一步深入研究其背后的分子机制（如特定蛋白冠形成、表面电荷密度、构象等），并探索更通用的、结构性规避策略（例如引入 PEG 化或两性离子修饰），将有助于指导未来肽基纳米载体的设计。
软骨下骨保护的独立性：si-VPN@HA 在 ACLT 模型中对软骨下骨的保护作用显著，尤其是在 PTOA 模型中表现优异。虽然 MMP-13 沉默可以间接保护软骨下骨，但该载体是否还通过其他机制（如直接作用于骨细胞、调节骨代谢相关因子）来发挥骨保护作用，值得进一步探讨。
临床转化的挑战：尽管动物实验结果喜人，但从实验室到临床的转化之路漫长且充满挑战。包括但不限于：大规模生产的成本和可行性、人体内的生物分布和药代动力学、长期毒性和免疫反应、以及伦理审批等。尤其是在关节腔给药的舒适度和依从性方面，仍需考虑。

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