1. 论文基本信息

1.1. 标题

Soil samples from sporotrichosis transmission belt area: Searching for fungal species and their antagonistic activity against Sporothrix brasiliensis (孢子丝菌病传播带区域的土壤样本：寻找真菌物种及其对巴西孢子丝菌的拮抗活性)

1.2. 作者

Gisela Lara da Costa, Isabella Escórcio Ferreira, Danielly Corrêa-Moreira, Anna Marinho, Adilson Benedito de Almeida, Sandro Antônio Pereira, Cintia Moraes Borba 和 Manoel Marques Evangelista Oliveira。

作者主要隶属于巴西里约热内卢 Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ (奥斯瓦尔多·克鲁兹研究所，菲奥克鲁兹) 的真菌分类学、生物化学和生物勘探实验室，以及 Evandro Chagas National Institute of Infectious Diseases, FIOCRUZ (埃万德罗·查加斯国家传染病研究所，菲奥克鲁兹) 的感染性疾病临床研究博士后项目和家畜皮肤病临床研究实验室。

1.3. 发表期刊/会议

该论文发表于 Frontiers in Cellular and Infection Microbiology (细胞与感染微生物学前沿) 期刊的 Fungal Pathogenesis (真菌致病性) 专题。Frontiers 系列期刊是开放获取的科学期刊，在各自领域内具有一定的影响力。

1.4. 发表年份

2022年。

1.5. 摘要

自1998年以来，巴西里约热内卢州因 Sporothrix spp. (孢子丝菌属) 引起的孢子丝菌病（一种与感染猫接触相关的疾病）而成为公共卫生问题。从环境来源分离这些物种的努力并非总能成功。本研究从里约热内卢市孢子丝菌病患猫居住的住宅土壤中采集样本并进行培养，试图分离 Sporothrix spp.，但未成功。然而，从土壤中分离并鉴定出其他腐生真菌物种，其中 Purpureocillium lilacinum (淡紫紫孢霉) 是最常见的。因此，研究决定探究该物种与 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌)（该州孢子丝菌病的主要致病菌）的体外相互作用。结果显示，十株 P. lilacinum 分离物以不同的抑制百分比抑制了 S. brasiliensis 的菌丝径向生长。它们之间的相互作用呈现出 overgrowth by antagonist (拮抗剂过度生长) 的模式。总之，研究数据表明，生长迅速且能产生代谢物的真菌物种可能阻碍 Sporothrix spp. 的生长，这也为鉴定具有生物活性并可用于对抗病原真菌的次级代谢产物开辟了道路。

1.6. 原文链接

/files/papers/691ac5c0110b75dcc59ae416/paper.pdf 发布状态：已正式发表。

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

2.1.1. 核心问题

论文旨在解决的核心问题是：为什么在孢子丝菌病高发区，从环境中（尤其是土壤）成功分离出致病菌 Sporothrix spp. (孢子丝菌属) (特别是 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌)) 的难度非常大，且成功率极低？同时，研究也探索了土壤中其他真菌物种是否对 Sporothrix spp. 具有拮抗作用。

2.1.2. 问题的重要性与现有挑战

• 公共卫生问题: 自1998年以来，巴西里约热内卢州孢子丝菌病发病率显著增加，特别是与感染猫相关的 人畜共患传播 (zoonotic transmission) (人畜共患传播) 成为一个严重的公共卫生问题。了解病原体在环境中的存在和行为，对于疾病的预防和控制至关重要。
• 环境作为储存库: 环境 (environment) 被认为是 S. brasiliensis 的一个潜在 储存库 (reservoir)，病猫可以通过病灶接触周围环境、粪便或埋葬尸体将真菌传播到环境中。然而，尽管有这种推测，但从环境中分离 Sporothrix spp. 的尝试却经常失败。
• 现有研究空白: 尽管一些研究通过 分子技术 (molecular techniques) (分子技术) 在环境样本中检测到了 S. brasiliensis 的 DNA (脱氧核糖核酸)，但成功的真菌分离案例却非常罕见，这使得研究人员难以直接研究其生态学和环境中的生存机制。这种分离的困难可能暗示了 土壤微生物群落 (soil microbial community) 中存在某种未知的 拮抗作用 (antagonistic actions)。

2.1.3. 切入点与创新思路

本研究的切入点是直接从里约热内卢州孢子丝菌病 传播带区域 (transmission belt area) 中患猫居住的住宅土壤中采集样本，试图分离 Sporothrix spp.。在未能成功分离出 Sporothrix spp. 的情况下，研究将重点转向了从这些土壤中分离出的其他 腐生真菌 (saprophytic fungal) 物种，并进一步探索这些分离出的真菌是否对 S. brasiliensis 具有 体外拮抗活性 (in vitro antagonistic activity)。这种思路的创新之处在于，它从“为何找不到”的困境中转向“是否存在某种抑制机制”，通过研究土壤中其他优势真菌的拮抗作用来解释 Sporothrix spp. 分离困难的现象。

2.2. 核心贡献/主要发现

• 未能从土壤中分离出 Sporothrix spp.: 尽管从孢子丝菌病高发区的土壤中进行了分离尝试，但未能成功分离到任何 Sporothrix spp. 菌株，这再次证实了先前研究中报告的这一挑战。
• 鉴定出优势腐生真菌 Purpureocillium lilacinum: 从土壤样本中分离并鉴定了多种 腐生真菌 (saprophytic fungal) 物种，其中 Purpureocillium lilacinum (淡紫紫孢霉) 是最常见的。
• P. lilacinum 对 S. brasiliensis 的体外拮抗活性: 实验结果显示，多株 P. lilacinum 分离物能够 体外 (in vitro) 抑制 S. brasiliensis 的菌丝径向生长，抑制百分比从8%到25%不等。
• 拮抗模式为“拮抗剂过度生长”: 两种真菌之间的相互作用被描述为 overgrowth by antagonist (拮抗剂过度生长)，即 P. lilacinum 最终覆盖并抑制了 S. brasiliensis 的生长。
• 提出真菌拮抗是分离困难的原因之一: 研究数据支持了快速生长且能产生 代谢物 (metabolites) 的真菌可能阻碍 Sporothrix spp. 生长的假说，为解释 Sporothrix spp. 环境分离困难提供了新的视角。
• 为未来药物发现提供方向: 研究结果为从 P. lilacinum 中分离、纯化和鉴定具有生物活性的 次级代谢产物 (secondary metabolites) 铺平了道路，这些产物可能被开发用于对抗 病原真菌 (pathogenic fungi)。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

• 孢子丝菌病 (Sporotrichosis): 一种由 Sporothrix 属真菌引起的 亚急性 (subacute) 或 慢性 (chronic) 感染。它是一种 热双相真菌病 (thermodimorphic mycosis)，主要表现为 皮下真菌病 (subcutaneous mycosis)，在热带和亚热带地区广泛流行。
• 孢子丝菌属 (Sporothrix spp.): 引起孢子丝菌病的真菌属，其特点是 热双相性 (thermodimorphism)，即在环境温度下（如25-30°C）以 菌丝 (mycelial) 形式生长，而在宿主温度下（如35-37°C）则以 酵母 (yeast) 形式生长。其中，S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 是巴西里约热内卢州人畜共患孢子丝菌病的主要病原体。
• 人畜共患传播 (Zoonotic Transmission): 指疾病从动物传播给人类。在里约热内卢州的孢子丝菌病疫情中，感染猫 (infected cats) 是人类感染的主要来源，通过抓伤或咬伤传播。
• 腐生真菌 (Saprophytic Fungi): 指那些通过分解死亡的有机物来获取营养的真菌。它们在生态系统中扮演着分解者的角色，通常不引起疾病，但在特定条件下也可能成为机会性病原体。
• 拮抗活性 (Antagonistic Activity): 指一个生物体通过产生 代谢物 (metabolites)、竞争 营养 (nutrients) 或 空间 (space) 等方式，抑制另一个生物体生长或活性的能力。在真菌生态学中，这是一种常见的相互作用。
• 菌丝生长 (Mycelial Growth): 真菌的主要生长形式，通过形成由细丝状结构（即 菌丝 (hyphae)）组成的网络（即 菌丝体 (mycelium)）来扩大其在培养基或环境中的范围。
• 双培养法 (Dual Culture Method): 一种 体外 (in vitro) 实验技术，用于评估两种微生物（通常是两种真菌）之间是否存在拮抗作用。通过将两种微生物在同一培养皿中接种并观察它们的生长情况和相互作用区域来判断。

3.2. 前人工作

• 孢子丝菌病流行病学: 自1998年以来，里约热内卢州的人类和猫孢子丝菌病病例显著增加，成为公共卫生问题 (Schubach et al., 2008; Gremião et al., 2020)。研究发现，大里约热内卢都市区与邻近市县交界处形成了一个孢子丝菌病 传播带 (transmission belt) (Silva et al., 2012)。最近的流行病学公报也显示该州所有行政区域均有病例 (Brasil, 2021)。分子分析明确指出 S. brasiliensis 是里约热内卢州人畜共患病的主要病原体 (Oliveira et al., 2011; Gremião et al., 2020)。
• 环境作为 S. brasiliensis 储存库的假说: Poester et al. (2018) 提出，在猫孢子丝菌病 高流行区 (hyperendemic areas)，环境可能作为 S. brasiliensis 的 储存库 (reservoir)，病猫通过病灶、粪便或埋葬尸体将真菌传播到环境中。
• 环境分离 Sporothrix spp. 的挑战: 尽管环境被认为是 Sporothrix 的潜在来源，但从环境中分离该物种的尝试通常不成功，或者分离率非常低 (Howard and Orr, 1963; Mackinnon et al., 1969; Kenyon et al., 1984; Dixon et al., 1991; Sanchez-Aleman et al., 2004; Mendoza et al., 2007; Metha et al., 2007; Criseo and Romeo, 2010; Cruz Choappa et al., 2014; Rodrigues et al., 2014; Poester et al., 2018)。Rabello et al. (2022) 在宠物猫患有孢子丝菌病的住宅中，只从猫本身分离出 S. brasiliensis，而未能从环境（废弃木材）中分离到。Almeida-Silva et al. (2022) 在孢子丝菌病流行区的农村地区土壤样本中，虽然通过 分子技术 (molecular techniques) (分子技术) 检测到 S. brasiliensis DNA (脱氧核糖核酸)，但同样未能观察到真菌生长。这些研究都凸显了直接分离 Sporothrix spp. 的困难。
• 真菌之间的拮抗作用: Boddy and Hiscox (2016) 指出，真菌在与其他微生物竞争时，可以通过快速生长、孢子形成、 应激恢复 (stress recovery) 以及产生和抵消 抑制剂 (inhibitors) 来克服竞争。Almeida-Silva et al. (2022) 也提到，真菌的快速生长速率等因素可能限制病原真菌（如 Sporothrix spp.）的生长。
• Purpureocillium lilacinum 的生物防治潜力: P. lilacinum (淡紫紫孢霉) 已被描述为一种 生物防治剂 (biocontrol agent)，可作为 昆虫寄生菌 (insect parasites) (Barra et al., 2015; Hotaka et al., 2015) 和 线虫寄生菌 (nematode parasites) (Singh et al., 2013; Liu et al., 2014)。此外，它也被报道能抑制其他真菌的生长，例如 Penicillium digitatum (指状青霉) (Elsherbiny et al., 2021) 和 Verticillium dahliae (大丽轮枝菌) (Lan et al., 2017)。P. lilacinum 也被发现能产生多种 代谢物 (metabolites)，如 leucinostatins (亮氨酸抑制素)、paecilotoxin (拟青霉毒素) 和 mycotoxin (霉菌毒素) (Mikami et al., 1989; Khan et al., 2003; Park et al., 2004; Sharma and Sharma, 2016)。

3.3. 技术演进

过去对 Sporothrix spp. 的环境研究主要集中在通过 培养法 (culture methods) 直接分离真菌。然而，由于分离成功率低，后续研究开始转向使用 分子工具 (molecular tools) 来检测环境中存在的 Sporothrix spp. DNA，以绕过培养困难。尽管 分子检测 (molecular detection) 可以确认 Sporothrix spp. 的存在，但它无法解释真菌为何难以分离，也无法揭示其在环境中的生态学行为。本研究在这种背景下，回溯到 培养法 (culture method)，并在此基础上，通过研究土壤中其他优势真菌的 拮抗作用 (antagonistic actions)，试图从生态学角度解释 Sporothrix spp. 分离困难的原因，从而弥补了分子检测所不能提供的机制性解释。

3.4. 差异化分析

本研究与先前工作的核心区别和创新点在于：

• 聚焦“分离困难”的机制: 大多数前人工作报告了从环境（尤其是土壤）中分离 Sporothrix spp. 的困难，或者仅通过 分子方法 (molecular methods) 检测其 DNA 存在。本研究则更进一步，在确认分离困难后，将研究重点转向探索这种困难背后的生物学机制——即是否存在其他真菌的 拮抗作用 (antagonistic actions)。
• 识别并量化 P. lilacinum 的拮抗作用: 本研究从土壤中分离出多种 腐生真菌 (saprophytic fungi)，并明确识别出 P. lilacinum (淡紫紫孢霉) 为最常见物种。更重要的是，研究首次 体外 (in vitro) 量化了 P. lilacinum 对 S. brasiliensis 的 菌丝径向生长抑制百分比 (Percentage Inhibition of Radial Growth, PIRG)，并描述了 拮抗剂过度生长 (overgrowth by antagonist) 的相互作用模式。
• 为药物发现提供新方向: 之前的 P. lilacinum 研究主要集中在其作为 昆虫 (insect) 和 线虫 (nematode) 生物防治剂的潜力。本研究则将其扩展到对抗 病原真菌 (pathogenic fungi) 的领域，并提出了其 次级代谢产物 (secondary metabolites) 在抗真菌药物开发中的潜力，为该领域开辟了新的研究方向。

4. 方法论

4.1. 方法原理

本研究的核心思想是通过调查孢子丝菌病 流行区 (endemic region) 的土壤样本，尝试分离出致病菌 Sporothrix spp. (孢子丝菌属)。当分离 Sporothrix spp. 未成功时，研究转而关注从这些土壤中分离出的其他 腐生真菌 (saprophytic fungi)。接着，利用 双培养法 (dual culture method) 在 体外 (in vitro) 评估这些优势腐生真菌，特别是 Purpureocillium lilacinum (淡紫紫孢霉)，对 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 生长的 拮抗活性 (antagonistic activity)。通过这种方式，研究旨在理解 Sporothrix spp. 难以从环境中分离的原因，并探索具有 生物活性 (biological activity) 的潜在拮抗真菌。

4.2. 核心方法详解 (逐层深入)

4.2.1. 土壤样本采集 (Soil samples)

研究人员从巴西里约热内卢州的 Petrópolis 和 Vassouras 城市的住宅土壤中采集样本。这些城市位于该州的 孢子丝菌病传播带 (sporotrichosis transmission belt) 内的 大西洋森林 (Atlantic Forest) 区域，且这些住宅中有患有孢子丝菌病的猫居住。采集方法是：在 地表以下10厘米 (10 cm below the topsoil) 处采集约 50克 (50 g) 土壤，并将其储存在 Falcon tubes (Falcon管) 中，随后运送至实验室进行处理。

4.2.2. 土壤真菌分离 (Isolation of fungi from soil samples)

为了从土壤样本中分离真菌，研究采用了 系列稀释技术 (serial dilution technique)，并将其接种到含有 马铃薯葡萄糖琼脂 (Potato Dextrose Agar, PDA) (PDA – Difco, Becton-Dickinson and Company, New Jersey, EUA) 培养基和 氯霉素 (chloramphenicol) 的 培养皿 (Petri dish) 中，该方法改编自 Clark (1965)。具体步骤如下：

1. 称重与悬浮: 精确称取 1克 (1 g) 土壤样本，放入 28 x 150 毫米 (28 x 150 mm) 的试管中。
2. 加入无菌水: 加入 10毫升 (10 mL) 无菌蒸馏水 (sterile distilled water)。
3. 均质化: 将试管在 涡旋振荡器 (vortex) 上均质 3分钟 (3 minutes)，以充分分散土壤颗粒和微生物。
4. 系列稀释: 从土壤悬浮液中取出 1毫升 (1 mL) 转移到另一个含有 9毫升 (9 mL) 无菌蒸馏水的试管中，进行 10倍稀释 (10-fold dilution)。重复此过程，制作一系列稀释度，范围从 $10^-1$ 到 $10^-5$。
5. 接种: 从 $10^-3$ 稀释度的溶液中取出 0.1毫升 (0.1 mL) 等分试样 (aliquots)，转移到含有 PDA 培养基和 0.05微克/毫升 (0.05 g.mL^-1) 氯霉素 (chloramphenicol) 的 培养皿 (Petri dishes) 中。氯霉素 (chloramphenicol) 的作用是 抑制细菌 (inhibiting bacteria) 生长，从而促进真菌的分离。
6. 孵育与监测: 将接种后的培养皿放置在 BOD型温度培养箱 (BOD-type temperature chamber) 中，在 28°C ± 1°C 的温度下孵育 7天 (seven days)，并进行日常监测。
7. 分离与保存: 挑取最具代表性的 菌落形成单位 (colony forming units, CFU)，将其分离并转移到含有相同培养基的试管中。这些试管保存在 BOD型空调培养箱 (BOD-type air-conditioned chamber) 中，温度控制在 28°C，用于后续的鉴定工作。

4.2.3. 真菌分离物的表型鉴定 (Identification by phenotypic characteristics of the fungal isolates)

真菌分离物的鉴定主要通过 宏观特征 (macroscopic characteristics) 和 微观形态 (micromorphological evaluation) 进行：

1. 宏观特征分析 (Macroscopic characteristics analysis):
   • 在 PDA 培养基上，于 28°C 孵育后进行观察。
   • 使用 Mitutoyo (Mitutoyo America Corporation, Aurora, Illinois, USA) 数字卡尺 (digital caliper) 测量菌落的直径，分辨率为 0.01毫米 (0.01 mm)。
   • 观察并记录其他与鉴定相关的特征，如 菌落质地 (texture)、分生孢子 (conidia) 颜色、菌丝体 (mycelium) 颜色及 菌落背面 (reverse) 颜色、渗出物 (exudate) 的存在与特征，以及 可溶性色素 (soluble pigments) 的产生 (Barron, 1972; Barnett and Hunter, 1998)。
2. 微观形态评估 (Micromorphological evaluation):
   • 采用 微培养法 (microcultures) (Riddell, 1950)，在 PDA 培养基上于 28°C 孵育 7天 (7 days)。
   • 将制备好的微培养物用 阿曼乳酚棉蓝溶液 (Amann lactophenol plus cotton blue solution) 染色 (staining)。
   • 使用 Nikon (Nikon Instruments Inc., Melville, NY, United States) E400型号 光学显微镜 (light microscope) 进行观察，以评估 真菌形态 (fungal morphology) 并进行 物种鉴定 (species identification)。

4.2.4. 双培养法筛选 (Screening by dual culture method)

为了评估从土壤中分离出的真菌物种对 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 的 拮抗活性 (antagonistic activity)，研究采用了 双培养测定法 (dual culture assay)，该方法改编自 Liu et al. (2020)。具体步骤如下：

1. 接种: 使用 铂环 (platinum loop) 取等量的 供试真菌 (putative antagonist) (即从土壤中分离出的真菌) 和 S. brasiliensis (CBS120339 型菌株)，分别在 PDA 培养基上进行 点接种 (point inoculated)。两种真菌菌株被放置在 培养皿 (Petri dish) 的相对两端，距离边缘 2厘米 (2 cm)。
2. 对照组: 作为对照，S. brasiliensis 单独接种在一个新的 PDA 培养皿中，放置方式相同。
3. 重复: 所有配对实验均进行 三重复 (triplicate)。
4. 孵育: 所有培养皿均在 28°C 下孵育 7天 (seven days)。
5. 拮抗活性评估:
   • 拮抗活性根据 Rahman et al. (2009) 的方法进行评估，通过测量 测试组 (test) 和 对照组 (control) 中两种真菌的生长情况。
   • 菌丝径向生长抑制百分比 (Percentage Inhibition of Radial Growth, PIRG) 使用 Skidmore and Dickinson (1976) 开发的公式计算： $$PIRG = \frac{(R1 - R2)}{R1} \times 100$$
     • 符号解释:
       • PIRG: Percentage Inhibition of Radial Growth (菌丝径向生长抑制百分比)。这个指标量化了拮抗真菌对 S. brasiliensis 菌丝生长的抑制程度。
       • R1: Radius of the S. brasiliensis colony (S. brasiliensis 菌落的径向半径) 在对照组培养皿中，即 S. brasiliensis 单独生长时的半径。
       • R2: Radius of the S. brasiliensis colony (S. brasiliensis 菌落的径向半径) 在双培养皿中，即 S. brasiliensis 与 供试拮抗真菌 (putative antagonist) 共同生长时的半径。
       • $\times 100$: 用于将计算结果转换为百分比形式，使其更直观地表示抑制效果。
6. 长期相互作用监测: 真菌物种之间的相互作用一直监测到 孵育的第28天 (28th day of incubation)，以观察长期的拮抗模式。

5. 实验设置

5.1. 数据集

• 土壤样本 (Soil Samples):
  • 来源: 样本采集自巴西里约热内卢州的 Petrópolis 和 Vassouras 城市，具体是患有 孢子丝菌病 (sporotrichosis) 的猫居住的住宅区域。这些区域位于里约热内卢州的 孢子丝菌病传播带 (sporotrichosis transmission belt) 内的 大西洋森林 (Atlantic Forest) 环境中。
  • 特点: 这些土壤样本代表了 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 可能存在或传播的环境，因此是研究其环境生态和与其他真菌相互作用的理想选择。
  • 样本数量: 文中没有直接说明土壤样本的具体数量，但提到了每个市采集的 CFU (菌落形成单位) 总数。
• 靶标真菌株 (Target Fungal Strain):
  • 种类: Sporothrix brasiliensis (巴西孢子丝菌)。
  • 株号: CBS120339。
  • 特点: 这是 S. brasiliensis 的 模式菌株 (type strain)，被用作对照，以评估从土壤中分离出的真菌的拮抗活性。选择该菌株是因为 S. brasiliensis 是里约热内卢州孢子丝菌病的主要致病菌。

5.2. 评估指标

本研究主要使用了以下评估指标：

• 菌落形成单位 (Colony Forming Units, CFU):
  1. 概念定义: CFU (菌落形成单位) 是微生物学中用于估算活的微生物细胞数量的一种常用单位。一个 CFU 并非总代表一个独立的细胞，它可能是一个单细胞、一个细胞团或一个菌丝片段，但在适宜的培养条件下，它们都能够生长并形成一个可见的菌落。该指标通常用于量化样本中可培养微生物（如细菌或真菌）的浓度，从而反映微生物的活力和数量。
  2. 数学公式: CFU 本身不是一个公式，而是通过计数培养皿上形成的菌落数量来直接得出。通常表示为每单位质量或体积的 CFU。 例如，如果从 1 g 土壤样本中稀释后接种的培养皿上计数到 $N$ 个菌落，且稀释度为 $D$，接种体积为 $V$ (mL)，则： $$\text{CFU/g} = \frac{N}{V \times D}$$
  3. 符号解释:
     • $N$: 计数到的培养皿上的菌落数量。
     • $V$: 接种到培养皿中的样本体积（通常为毫升）。
     • $D$: 样本的稀释倍数（例如，如果稀释了 $10^-3$ 倍，则 $D=10^{-3}$）。
     • CFU/g: 每克土壤样本中的菌落形成单位数量。
• 菌丝径向生长抑制百分比 (Percentage Inhibition of Radial Growth, PIRG):
  1. 概念定义: PIRG (菌丝径向生长抑制百分比) 是衡量一种真菌（或任何其他物质）对另一种真菌 菌丝体 (mycelial) 径向扩展生长抑制程度的定量指标。通过比较目标真菌在存在拮抗剂和不存在拮抗剂两种情况下的菌落径向生长距离，以百分比形式直观地表示抑制效果。较高的 PIRG 值表明更强的抑制作用。
  2. 数学公式: $$PIRG = \frac{(R1 - R2)}{R1} \times 100$$
  3. 符号解释:
     • PIRG: Percentage Inhibition of Radial Growth (菌丝径向生长抑制百分比)。
     • R1: Radius of the S. brasiliensis colony (S. brasiliensis 菌落的径向半径) 在对照组培养皿中（即 S. brasiliensis 单独生长时的半径）。
     • R2: Radius of the S. brasiliensis colony (S. brasiliensis 菌落的径向半径) 在双培养皿中（即 S. brasiliensis 与拮抗真菌共同生长时的半径）。
     • $\times 100$: 将计算结果转换为百分比形式。

5.3. 对比基线

本研究没有采用传统意义上的“基线模型”进行比较，而是将 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 单独培养作为 对照组 (control group)。这种对照的目的是为了：

1. 确定 S. brasiliensis 的正常生长速率: 通过在相同条件下单独培养 S. brasiliensis，可以获得其不受其他真菌影响的 菌丝径向生长 (radial mycelial growth) 速率和最终大小，作为评估拮抗效果的基准。

2. 量化拮抗作用: 所有的 菌丝径向生长抑制百分比 (PIRG) 都是相对于这个 对照组 (control) 来计算的。如果 供试真菌 (test fungus) 对 S. brasiliensis 没有抑制作用，则其生长半径 R2 应接近对照组的 R1，导致 PIRG 接近0。

   这种对照设置是研究微生物 拮抗作用 (antagonistic activity) 的标准方法，能够有效地验证 供试真菌 (test fungus) 的 抑制性能 (inhibitory performance)。

6. 实验结果与分析

6.1. 核心结果分析

6.1.1. 土壤样本中的真菌种类

• Sporothrix sp. (孢子丝菌属) 未分离成功: 尽管研究地点位于 孢子丝菌病传播带 (sporotrichosis transmission belt)，但从所有土壤样本中均未能分离到 Sporothrix sp.，这与此前其他研究中遇到的困难一致。

• 总 CFU (菌落形成单位) 数量: 从 Petrópolis (Pe) 和 Vassouras (Va) 两个市的土壤样本中，共获得了 143个 菌落形成单位 (CFU) (Pe-46, Va-97)。

• 真菌类型分布: 在这些 CFU 中，137个 是 丝状真菌 (filamentous fungi)，6个 是 酵母样菌 (yeast-like colonies) (酵母样菌未纳入本研究的评估范围)。

• 鉴定出的真菌属: 通过 经典分类学 (classical taxonomy) 方法，共鉴定出八个真菌属。其中，Purpureocillium sp. (紫孢霉属) 的分离物数量最多，达到 35个 (Pe-6/Va-29)。其次是 Penicillium sp. (青霉属) (16个)、Aspergillus sp. (曲霉属) (7个)、Beauveria sp. (白僵菌属) (5个)、Trichoderma sp. (木霉属) (5个)、Fusarium sp. (镰刀菌属) (5个)、Metarhizium sp. (绿僵菌属) (4个) 和 Scopulariopsis sp. (帚状枝孢属) (1个)。 以下是原文 Figure 1 的结果：

  该图像是饼图，展示了从土壤样本中分离出的不同真菌种类的数量分布。各部分颜色代表不同的真菌属，最大类别为 Aspergillus sp.（35个分离物），其次是 Purpureocillium sp.（16个分离物），以及其他真菌种类如 Beauveria sp. 和 Fusarium sp. 等。

• 物种水平鉴定: 对 63个 分离物进行了物种水平鉴定，结果如下：

  • Purpureocillium lilacinum (淡紫紫孢霉): Pe-6/Va-29
  • Penicillium citrinum (桔青霉): Pe-2/Va-4
  • Penicillium decumbens (平卧青霉): Va-5
  • Penicillium expansum (扩展青霉): Pe-2
  • Penicillium pinophilum (喜松青霉): Pe-2
  • Penicillium oxalicum (草酸青霉): Pe-1
  • Aspergillus versicolor (杂色曲霉): Pe-1/Va-3
  • Aspergillus fumigatus (烟曲霉): Va-1
  • Aspergillus clavatus (棒状曲霉): Va-1
  • Aspergillus sydiwii (西地曲霉): Va-1
  • Metharhizium anisopliae (绿僵菌): Pe-3/Va-1
  • Scopulariopsis brevicaulis (短帚状枝孢): Pe-1
  • Mycellia sterilia (无菌丝): 另外 25个 分离物没有产生任何已知的孢子，被鉴定为 无菌丝 (Mycellia sterilia) (4Pe, 21Va)。

6.1.2. 真菌对 Sporothrix brasiliensis 的拮抗活性

• 供试真菌的选择: 选择了在两个市中都存在的三种真菌 (P. lilacinum、A. versicolor 和 M. anisopliae) 进行拮抗筛选测试。

• A. versicolor 和 M. anisopliae 的限制: A. versicolor (杂色曲霉) 和 M. anisopliae (绿僵菌) 的菌落生长速度过快，在 7天 (7 days) 内就过度生长，导致无法准确测量其对 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 的抑制潜力。

• P. lilacinum 的拮抗作用: 10株 P. lilacinum (淡紫紫孢霉) 分离物均表现出对 S. brasiliensis 菌丝径向生长 (radial mycelial growth) 的抑制作用。菌丝径向生长抑制百分比 (PIRG) 的平均值范围从 8% 到 25%。这表明 P. lilacinum 具有不同程度的拮抗能力。

  以下是原文 Table 1 的结果：

  Isolates	PIRG (%)
  LTBBF-PL1	18.51
  LTBBF-PL2	11.11
  LTBBF-PL3	8.00
  LTBBF-PL4	21.73
  LTBBF-PL5	25.00
  LTBBF-PL6	21.70
  LTBBF-PL7	8.00
  LTBBF-PL8	15.38
  LTBBF-PL9	18.18
  LTBBF-PL10	15.38

• 拮抗模式: 两种真菌（P. lilacinum 和 S. brasiliensis）之间的相互作用模式被描述为 overgrowth by antagonist (拮抗剂过度生长)，这是 Porter (1924) 描述的一种模式，并在 Skidmore and Dickinson (1976) 中被引用。这意味着拮抗真菌（P. lilacinum）的生长速度更快，最终覆盖并抑制了 S. brasiliensis 的生长。在孵育的第7天，所有 P. lilacinum 分离物均未覆盖 S. brasiliensis 菌落，但在 28天 (28 days) 的孵育过程中观察到了 过度生长 (overgrowth) 现象。

6.1.3. 图像分析

• Figure 1 (真菌属分布图): 该饼图清晰地展示了从土壤样本中分离出的真菌属的相对丰度。Purpureocillium sp. 占据了最大的比例 (35个 分离物)，证实了其在该研究区域土壤中的优势地位，这为后续选择其进行拮抗活性测试提供了依据。

• Figure 2 (7天孵育后的拮抗效果图): 该图以视觉方式展示了在 7天 (7 days) 孵育后，两株 P. lilacinum 分离物 (LTBBF-PL4 和 LTBBF-PL9) 对 S. brasiliensis 生长的抑制效果。与 S. brasiliensis 单独生长的 对照组 (control) 相比，在存在 P. lilacinum 的情况下，S. brasiliensis 的菌落生长明显受到限制，菌落直径更小。这直观地支持了 P. lilacinum 具有拮抗活性的发现，并展示了不同分离株间的抑制效果差异 (LTBBF-PL4 抑制 21.73%，LTBBF-PL9 抑制 18.18%)。 以下是原文 Figure 2 的结果：

  该图像是图表，展示了在第7天培养后的两组样本。左侧为LTBBF-PL4，抑制率为 $21.73\\%$；右侧为LTBBF-PL9，抑制率为 $18.18\\%$。

• Figure 3 (28天孵育后的过度生长图): 该图展示了在 28天 (28 days) 的长期孵育后，P. lilacinum 如何 过度生长 (overgrowth) S. brasiliensis。与 S. brasiliensis 的 对照组 (control) 相比，P. lilacinum 菌落明显扩张，并侵占了 S. brasiliensis 的生长区域，甚至覆盖了其菌落。这证实了两种真菌之间 拮抗剂过度生长 (overgrowth by antagonist) 的相互作用模式，进一步解释了 P. lilacinum 抑制 S. brasiliensis 的物理机制。 以下是原文 Figure 3 的结果：

  该图像是图表，展示了 S. brasiliensis 的对照组与在 P. lilacinum 存在下的成长情况。图中箭头标示出两组样本中 S. brasiliensis 的生长差异，右侧样本显示出 P. lilacinum 对 S. brasiliensis 的抑制作用。

6.1.4. 结果验证与优劣势

• 有效性验证:
  • 重复验证分离困难: 本研究再次证实了从 孢子丝菌病 (sporotrichosis) 流行区环境中直接分离 Sporothrix spp. 的困难，支持了之前多项研究的发现。
  • 量化拮抗作用: 首次 体外 (in vitro) 量化了 P. lilacinum 对 S. brasiliensis 的 菌丝径向生长抑制百分比 (PIRG)，并观察到 拮抗剂过度生长 (overgrowth by antagonist) 的现象，为 Sporothrix spp. 环境分离困难提供了一个可能的生物学解释。
• 优势:
  • 生态学视角: 从生态学相互作用的角度解释病原体分离困难，是该研究的独特贡献。
  • 新颖的生物防治线索: 发现 P. lilacinum 对 S. brasiliensis 的拮抗作用，为开发针对孢子丝菌病的 生物防治策略 (biocontrol strategies) 或 抗真菌药物 (antifungal compounds) 提供了潜在线索。P. lilacinum 已知能产生多种 次级代谢产物 (secondary metabolites)，这支持了其作为 拮抗剂 (antagonist) 的机制。
• 劣势:
  • 缺乏分子验证: 论文作者也承认，未能在土壤样本中进行 分子检测 (molecular detection) (DNA 验证) 是一个 缺陷 (deficiency)。这意味着无法确认 Sporothrix spp. 的 DNA 是否在土壤中存在但未能被培养出来，从而无法完全排除其他非生物因素导致分离失败的可能性。
  • 纯 体外 (in vitro) 实验: 拮抗作用仅在 体外培养 (in vitro culture) 中观察到。实际土壤环境是高度复杂的，其 相互作用 (interactions) 可能涉及更多的微生物、 营养 (nutrients) 竞争、pH (酸碱度)、温度 (temperature)、湿度 (humidity) 等因素，体外 (in vitro) 结果不一定完全反映 体内 (in vivo) 情况。
  • 未鉴定代谢产物: 尽管推测拮抗作用与 代谢产物 (metabolites) 有关，但研究并未进一步分离和鉴定这些具体的 抗真菌代谢产物 (antifungal metabolites)。

6.2. 消融实验/参数分析

论文中没有进行 消融实验 (ablation experiment) 或 参数分析 (parameter analysis)。研究主要关注的是从土壤中分离真菌以及评估它们之间的 拮抗作用 (antagonistic activity)，而不是优化某个模型或系统组件。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究从巴西里约热内卢州孢子丝菌病传播带区域的患猫住宅土壤中采集样本，旨在分离 Sporothrix spp. (孢子丝菌属) 但未成功，再次印证了从环境中分离该病原体的困难。然而，研究成功分离并鉴定出多种 腐生真菌 (saprophytic fungi)，其中 Purpureocillium lilacinum (淡紫紫孢霉) 是最常见的。通过 体外双培养法 (in vitro dual culture method)，研究发现十株 P. lilacinum 分离物均能有效抑制 S. brasiliensis (巴西孢子丝菌) 的 菌丝径向生长 (radial mycelial growth)，抑制率介于8%至25%之间，其相互作用模式为 拮抗剂过度生长 (overgrowth by antagonist)。这些结果强烈表明，土壤中快速生长并能产生 代谢物 (metabolites) 的真菌，如 P. lilacinum，可能是阻碍 Sporothrix spp. 在环境中共存或被成功分离的关键因素。该研究不仅解释了 Sporothrix spp. 分离困难的潜在机制，也为未来从 P. lilacinum 中分离、纯化和鉴定具有 生物活性 (biological activity) 的 次级代谢产物 (secondary metabolites) 提供了新的研究方向，这些产物有望用于开发新型 抗真菌药物 (antifungal drugs)。

7.2. 局限性与未来工作

7.2.1. 局限性

论文作者指出本研究的一个主要局限性是缺乏使用分子工具来检测土壤样本中 Sporothrix spp. DNA 的存在。这意味着研究无法确认 Sporothrix spp. 是否真的不存在于土壤中（因此未能分离），或者它们以某种形式存在（例如休眠孢子、低丰度或与培养条件不兼容），但由于其他真菌的 拮抗作用 (antagonistic actions) 或其他环境因素，导致无法通过 培养法 (culture method) 成功分离。

7.2.2. 未来工作

基于上述局限性，作者提出了明确的未来研究方向：

1. 引入分子工具: 未来的研究步骤将包括使用 分子方法 (molecular methodologies) (如 PCR 或 DNA 测序 (DNA sequencing)) 来精确检测和识别 土壤样本 (soil samples) 中的 真菌物种 (fungal species)，特别是 Sporothrix spp.，以补充 培养法 (culture-based methods) 的不足。
2. 次级代谢产物鉴定: 进一步的工作将集中于分离、纯化和鉴定 P. lilacinum (淡紫紫孢霉) 所产生的具有 生物活性 (biological activity) 的 次级代谢产物 (secondary metabolites)。
3. 抗真菌活性测试: 对鉴定出的 次级代谢产物 (secondary metabolites) 进行 体外 (in vitro) 和 体内 (in vivo) 测试，评估其对抗 病原真菌 (pathogenic fungi) 的潜力，为开发新型 抗真菌药物 (antifungal drugs) 奠定基础。

7.3. 个人启发与批判

7.3.1. 个人启发

这篇论文提供了几个重要的启发点：

• 生态学在疾病控制中的作用: 强调了了解病原体在自然环境中的生态学行为和与其他微生物的相互作用，对于疾病预防和控制的重要性。仅仅关注病原体本身是不够的，还需要理解其所处的 微生物群落 (microbial community) 的动态。
• “找不到”的深层含义: Sporothrix spp. 分离困难的现象，不再仅仅是技术上的挑战，而可能指向一种自然的生态平衡或 生物控制 (biocontrol) 机制。这种从“负面结果”中挖掘“正面信息”的思维方式值得借鉴。
• P. lilacinum 的多功能性: P. lilacinum 传统上被认为是 昆虫 (insect) 和 线虫 (nematode) 的 生物防治剂 (biocontrol agent)。本研究揭示了其在 真菌对真菌 (fungus-on-fungus) 拮抗方面的潜力，特别是对人类 病原真菌 (pathogenic fungi) 的抑制作用，这极大地扩展了其应用前景，可能成为新的 抗真菌药物 (antifungal drugs) 来源。
• 快速生长的生态优势: 论文结果再次证明了在微生物竞争中，快速生长 (very fast growth) 是一种强大的生态优势，它能帮助优势物种占据 生态位 (niche) 并抑制竞争者。

7.3.2. 批判

• 缺乏 分子生物学 (molecular biology) 证据的缺失影响: 论文的 局限性 (limitation) 提到缺乏 Sporothrix spp. DNA 的 分子检测 (molecular detection)，这确实是一个显著的不足。如果土壤中根本没有 Sporothrix spp. DNA，那么分离失败就无关拮抗作用；如果 DNA 存在但无法培养，那么拮抗作用的可能性就大大增加。这种不确定性削弱了“拮抗作用是分离困难原因”这一结论的普适性。
• 体外 (in vitro) 结果的推广性挑战: 实验室 体外 (in vitro) 实验条件是高度简化的，而自然土壤环境极其复杂，包含多种 微生物 (microorganisms)、无机物 (inorganic substances)、有机质 (organic matter)、pH (酸碱度)、湿度 (humidity)、温度梯度 (temperature gradients) 等因素。P. lilacinum 在 体外 (in vitro) 表现出的 拮抗活性 (antagonistic activity) 是否能在真实土壤环境中以相同强度和机制发挥作用，需要进一步的 体内 (in vivo) 或模拟 自然环境 (natural environment) 的实验来验证。
• 机制探索的深度不足: 论文提出了 代谢产物 (metabolites) 可能是拮抗作用的机制，但并未进行深入的化学分析来鉴定这些 代谢产物 (metabolites)。仅仅停留在推测层面，虽然为未来工作提供了方向，但在当前研究中，对 抑制机制 (inhibitory mechanism) 的阐释略显不足。例如，是产生了 抗真菌化合物 (antifungal compounds)，还是通过 营养竞争 (nutrient competition)，或是 空间竞争 (spatial competition)，抑或是 寄生作用 (parasitism)？这些具体机制仍需探索。
• 特定菌株的普适性: 研究仅使用了一株 S. brasiliensis 模式菌株 (type strain) (CBS120339)。不同 S. brasiliensis 菌株 (strains) 之间可能存在 遗传变异 (genetic variability)，对 拮抗剂 (antagonists) 的敏感性也可能不同。同样，不同 P. lilacinum 分离物 (isolates) 之间的拮抗强度也存在差异，这表明其拮抗能力并非均一。未来的研究可以考虑更广泛的 菌株 (strains) 集合进行测试。
• 定量方法的局限性: 菌丝径向生长抑制百分比 (PIRG) 是一种有效的 定量方法 (quantitative method)，但它主要反映 二维平面 (two-dimensional plane) 上的生长抑制。在三维的土壤环境中，真菌的生长和相互作用可能更为复杂。