1. 论文基本信息

1.1. 标题

生长耦合的微生物生物合成动物色素黄素 (Growth-coupled microbial biosynthesis of the animal pigment xanthommatin)

1.2. 作者

Leah B. Bushin, Tobias B. Alter, María V. G. Alván-Vargas, Lara Dürr, Elina C. Olson, Mariah J. Avila, Daniel C. Volke, Oscar Puiggené, Taehwan Kim, Leila F. Deravi, Adam M. Feist, Pablo I. Nikel & Bradley S. Moore

1.3. 发表期刊/会议

Nature Biotechnology。 该期刊在生物技术和生物工程领域享有极高的声誉和影响力，是发表高影响力、突破性研究成果的顶级期刊之一。

1.4. 发表年份

2025年11月03日 (Published online: 03 November 2025)

1.5. 摘要

通过基因工程将异源天然产物通路引入细菌已取得广泛成功，但大多数方法都面临初始产量低的问题，需要大量资源密集型的迭代菌株优化。黄素 (Xanthommatin) 是一种结构复杂、会变色的动物眼色素 (ommochrome)，具有材料和化妆品应用潜力，但在微生物细胞工厂中生产一直很困难。本文介绍了一种生长耦合的生物合成策略，该策略涉及一个反馈回路，其中一个被切除的一碳 (C1) 基团被用作细菌生长的驱动力，同时促进了目标化合物的生物生产。这种广泛适用、即插即用的策略通过在平台土壤细菌 Pseudomonas putida 的5,10-亚甲基四氢叶酸 (5,10-methylenetetrahydrofolate, MTHF) 缺陷型菌株中实现黄素生物合成得到例证。在该设计中，黄素生产过程中释放的甲酸 (formate) 缓解了 C1 缺陷，从而有效地将细菌生长与色素合成耦合起来。自适应实验室进化 (adaptive laboratory evolution, ALE) 简化了黄素从葡萄糖进行克级生物生产的过程，确立了 C1 恢复作为加速细菌天然产物生物合成工程的通用方法。

1.6. 原文链接

/files/papers/692312d8f5731101a527de36/paper.pdf (发布状态：已正式发表)

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

论文试图解决的核心问题： 尽管基因工程在细菌中构建异源天然产物通路方面取得了巨大成功，但面临两个主要挑战：

1. 初始产量低： 大多数方法在初步生产阶段的产量都非常低。
2. 优化成本高： 提高产量需要进行广泛、资源密集且耗时的迭代菌株优化 (iterative strain optimization) 工作流。 具体到黄素 (Xanthommatin) 这种复杂的动物色素，其在微生物细胞工厂中的生产尤其困难，而传统的化学合成和动物组织提取方法存在产量低、纯度差和难以规模化的问题。

为什么这个问题在当前领域是重要的？ 天然产物在医药、材料和化妆品等领域具有广泛应用。微生物细胞工厂为获取这些复杂分子提供了一条可持续、可规模化的途径。然而，当前生产效率的瓶颈限制了其商业化和更广泛的应用。解决这些瓶颈，尤其是提高初始产量并减少优化成本，对于推动合成生物学和代谢工程的工业应用至关重要。

现有研究存在的具体挑战或空白：

• 代谢负担： 异源通路通常给宿主带来巨大的代谢负担，却不提供生存优势。
• 生长耦合的局限性： 虽然生长耦合策略 (growth-coupling strategies) 已成功应用于简单代谢产物（如乳酸、琥珀酸），但对于结构复杂的异源天然产物，其应用仍不充分。现有的生长耦合方法通常将生长与内源性前体代谢物的合成耦合，而非直接与异源通路的终产物耦合，未能反映异源通路的直接生长依赖性。
• 非通用性： 大多数生长耦合设计高度依赖于特定的目标化合物，缺乏普适性。

这篇论文的切入点或创新思路： 本文提出了一种新颖的“生长耦合生物合成策略”或“反馈回路”：

1. 利用原子效率不高的副产物： 许多生物合成通路并非原子效率很高，会在合成终产物的过程中产生含碳副产物。
2. 工程化缺陷型菌株： 将细胞代谢重新编程，使其对这些含碳副产物（特别是单碳分子，C1 moiety）产生严格的依赖（即成为缺陷型 auxotroph）。
3. 直接生长依赖： 这样，微生物的生长将严格与目标化合物的生物生产耦合。目标化合物的合成过程释放的 C1 副产物能够缓解宿主菌株的缺陷，从而驱动其生长。
4. 普适性： 这种策略旨在实现“即插即用”的普适性，使其与目标产物无关，只要目标产物的生物合成途径中释放合适的 C1 副产物即可。

2.2. 核心贡献/主要发现

论文最主要的贡献：

1. 提出并验证了 C1 生长耦合生物合成策略： 首次成功将复杂的异源天然产物（黄素）的生物合成与微生物生长直接耦合，通过一个“反馈回路”——异源通路释放的 C1 副产物驱动宿主生长。
2. 实现了克级高纯度黄素生物生产： 在工程化 Pseudomonas putida 菌株中，从葡萄糖实现了克级（2.4 g/L）高纯度黄素的生物生产，克服了传统方法产量低、难以规模化的限制。
3. 通过自适应实验室进化 (ALE) 优化了生产菌株： 利用 ALE 有效地“戒掉”了菌株对额外氨基酸补充的需求，使其能够仅以葡萄糖为碳源生长并生产。

论文得出的关键结论或发现：

• MTHF 缺陷型菌株 PUMA 的成功构建： 在 P. putida 中通过基因删除和异源通路插入，创建了一个对 C1 单元（甲酸）具有严格缺陷的菌株 PUMA。
• 异源犬尿酸 (kynurenine) 通路作为 C1 来源： 引入的犬尿酸生物合成通路在将色氨酸 (L-tryptophan) 转化为犬尿酸的过程中释放甲酸，成功地缓解了 PUMA 菌株的 C1 缺陷，从而支持其生长。
• 生长驱动生产的有效性： 具有生长耦合机制的 PUMA 衍生物（PUMA-Kyn 和 PUMA-Xa）在生产犬尿酸类分子方面表现出比亲本菌株 EM42 高得多的产量。
• ALE 的非预期发现： ALE 过程揭示了 metK 基因（编码 S-腺苷-L-甲硫氨酸合酶, S-adenosyl-L-methionine synthase）的突变可以解除菌株对甘氨酸 (glycine) 的依赖，这出乎意料地揭示了 metK 在甘氨酸代谢中的作用。
• 途径启动子区域的适应性进化： 菌株对色氨酸依赖性的解除归因于表达质粒上 P_EM7 启动子区域的突变，表明微生物通过调整基因表达来适应代谢需求。
• 生物合成黄素的优良性能： 生物合成的黄素在光电特性上与化学合成的黄素高度相似，具有广泛的应用前景。
• C1 恢复作为通用策略的潜力： 本研究验证了 C1 恢复作为一种通用生物合成方法，能够加速多种天然产物在细菌中的工程化生产。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

3.1.1. 异源天然产物生物合成 (Heterologous Natural Product Biosynthesis)

指将一种生物（通常是植物、真菌或其他微生物）的天然产物合成基因通路，通过基因工程的方法，转移并表达至另一种易于培养的微生物宿主（如细菌或酵母）中，从而利用该宿主生产目标天然产物的过程。这种方法能够解决天然产物来源稀少、提取困难或化学合成复杂的问题。

3.1.2. 迭代菌株优化 (Iterative Strain Optimization)

在微生物工程中，为了提高目标产物的产量、速率和产率，通常需要通过“设计-构建-测试-学习 (Design-Build-Test-Learn, DBTL)”的循环工作流程，对工程菌株进行多轮的基因改造、培养条件调整和性能评估。这个过程是迭代的，直到达到满意的生产水平。

3.1.3. 代谢负担 (Metabolic Burden)

当宿主细胞表达异源基因或运行异源代谢通路时，会消耗细胞的能量、碳源、氮源和其他代谢资源，并可能产生有毒中间产物，从而对宿主细胞的正常生理功能和生长产生负面影响，这种现象被称为代谢负担。严重的代谢负担会导致细胞生长缓慢、生物量减少，最终影响目标产物的生产。

3.1.4. 生长耦合策略 (Growth-Coupling Strategy)

是一种代谢工程方法，旨在通过重塑细胞代谢通路，将目标产物的生物合成与宿主细胞的生长（生物量生成）直接关联起来。理想的生长耦合是，当细胞生长时，它必须同时生产目标产物，或者目标产物的生产直接为细胞生长提供必要的代谢物或能量。这样，对细胞生长的选择压力就能间接驱动目标产物的生产，避免了不必要的优化。

3.1.5. 缺陷型 (Auxotroph)

指一类因基因突变而无法自身合成某些必需的代谢物（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的微生物菌株。这类菌株必须从外部环境中获取这些必需的代谢物才能生长。在代谢工程中，通过工程化手段制造缺陷型菌株，可以用于生长耦合策略，即让目标产物的合成过程间接提供这些必需代谢物，从而“拯救”缺陷型菌株的生长。

3.1.6. 一碳 (C1) 代谢 (One-Carbon Metabolism)

是指涉及单碳单位（如甲酸 formate、甲醛 formaldehyde、二氧化碳 CO2、亚甲基-四氢叶酸 methylenetetrahydrofolate 等）的生物化学反应网络。这些 C1 单位在细胞中扮演着关键角色，参与核苷酸、氨基酸（如蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸）的合成，以及甲基化反应等。叶酸循环 (folate cycle) 是 C1 代谢的核心，负责捕获、转化和利用这些 C1 单位。

3.1.7. 黄素 (Xanthommatin)

黄素是一种复杂的、结构多样的动物眼色素 (ommochrome)，属于犬尿酸 (kynurenine) 衍生物。它在动物界广泛存在，尤其在节肢动物（如昆虫、蜘蛛）和头足类动物（如鱿鱼、章鱼）中，参与形成颜色模式、伪装、视觉以及求偶展示等功能。黄素具有光电特性，使其在生物材料和化妆品等领域具有潜在应用。

3.1.8. 铜绿假单胞菌 (Pseudomonas putida)

一种革兰氏阴性、好氧的土壤细菌，以其广泛的代谢能力、对多种有毒底物和产物的高耐受性而闻名。P. putida 已成为代谢工程和合成生物学的平台宿主，用于生产各种化学品和生物材料。

3.2. 前人工作

• 异源天然产物生产的挑战： 之前的研究（例如参考文献 [4, 5, 6, 7]）已经指出，虽然合成生物学工具和方法日益成熟，但微生物宿主在初始阶段通常只能生产微量的目标化合物，需要大量迭代的 DBTL 工作流来提高产量。
• 生长耦合的现有应用： 生长耦合策略已成功应用于相对简单的代谢产物生产，例如乳酸 (lactate)、琥珀酸 (succinate) 和 1,3-丙二醇 (1,3-propanediol) 等（参考文献 [8-14]）。这些方法通常通过基因删除来重塑代谢流，使目标化合物成为微生物生长的副产物。
• 异源天然产物生长耦合的局限： 现有将生长耦合应用于异源天然产物生产的例子，主要集中于将生长与内源性前体代谢物的合成耦合，而不是直接与异源通路产生的终产物耦合（参考文献 [15]）。例如，参考文献 [15] 中靛蓝啶 (indigoidine) 的生长耦合生产，是将生物量与谷氨酰胺 (glutamine)（作为前体）耦合，而非与最终产品靛蓝啶本身耦合。
• C1 代谢工程的进展： 近年来，在工程化微生物以利用 C1 化合物作为可再生原料方面取得了重要进展（参考文献 [23-25]）。通过引入合成缺陷并利用外部添加的 C1 底物来缓解缺陷，从而将 C1 单元整合到中心代谢中。这些缺陷通常围绕甘氨酸或丝氨酸节点设置，并依赖于叶酸循环。
• 叶酸循环的重要性： 叶酸循环是 C1 代谢的核心，支持嘌呤 (purine) 和胸苷 (thymidine) 合成，以及同型半胱氨酸 (homocysteine) 的再甲基化，后者是甲硫氨酸 (methionine) 合成的关键前体。

3.3. 技术演进

代谢工程领域从最初通过随机诱变和筛选，发展到基于基因组规模代谢模型 (genome-scale metabolic model) 的理性设计，再到结合高通量筛选和自适应实验室进化 (ALE) 的半理性或自动化方法。生长耦合策略代表了理性设计的一个重要方向，它试图将产品生产与细胞的生存压力直接挂钩，从而利用进化的力量来优化生产。本文的工作在此基础上更进一步，将生长耦合应用于复杂的异源天然产物，并通过 C1 代谢通路实现通用性。

3.4. 差异化分析

本文的方法与相关工作中的主要方法相比，核心区别和创新点在于：

• 直接耦合异源终产物： 之前的生长耦合多将生长与内源前体或简单代谢物耦合，而本文通过将异源通路产生的 C1 副产物作为生长恢复因子，实现了异源通路产物（黄素）与细胞生长的直接耦合，使黄素成为工程菌株的“初级代谢产物”。
• 普适性“即插即用”策略： 通过利用许多生物合成通路中普遍存在的 C1 副产物释放机制，本文提出的策略具有更广泛的适用性，理论上可应用于任何在合成过程中释放 C1 单元（如甲酸）的目标产物，而无需为每个特定产物设计高度定制的生长耦合方案。这与以往高度定制的生长耦合设计（如参考文献 [9, 10, 15-17]）形成鲜明对比。
• 生产平台与筛选工具的统一： 在本文的策略中，缺陷型菌株可以直接作为生产平台使用，而不是仅仅作为筛选工具进行酶的定向进化后需要重新工程化到非缺陷型宿主中。这意味着高产菌株可以直接用于大规模生产，减少了额外的工程步骤。
• 简单培养基中的生产： 本文成功在仅以葡萄糖为唯一碳源的简单培养基中实现了复杂天然产物的生长耦合生产，无需额外的基质或前体补充，这对于工业应用具有重要意义。

4. 方法论

本文设计、构建并表征了一种在代谢多样的土壤细菌 Pseudomonas putida 中实现生长耦合生物合成动物色素黄素的策略。核心思想是通过创建一个5,10-亚甲基四氢叶酸 (MTHF) 缺陷型菌株，并利用异源天然产物通路（犬尿酸通路）合成过程中释放的甲酸 (formate) 来缓解该缺陷，从而将目标产物黄素的生产与细菌生长直接耦合。

4.1. 方法原理

该方法的核心原理是建立一个反馈回路 (feedback loop)，将异源天然产物的生产与宿主细菌的生长紧密联系起来。具体步骤如下：

1. 创建合成缺陷型菌株： 通过基因工程手段，在宿主细菌中引入一个合成缺陷 (synthetic auxotrophy)，使其无法合成某种对于生长至关重要的代谢物。

2. 整合异源生物合成通路： 引入目标天然产物的异源生物合成通路。选择的通路必须在合成目标产物的过程中，能够释放出一种可以缓解上述合成缺陷的代谢副产物 (metabolic byproduct)。

3. 构建副产物再利用通路： 同时，宿主菌株还需要工程化一个通路，能够有效同化 (assimilate) 这种副产物，并将其转化为缺失的必需代谢物。

4. 生长耦合： 通过这种设计，宿主细菌的生存（即生长）将严格依赖于异源通路中目标产物的生产，因为只有生产目标产物才能释放必需的副产物，进而维持自身生长。这样，对细菌生长的选择压力就直接转化为对目标产物生产的压力。

   本文选择的是 一碳 (C1) 基团代谢 作为生长耦合的媒介。具体地，在 P. putida 中创建了 MTHF 缺陷型 (MTHF auxotroph) 菌株，并利用犬尿酸通路在合成过程中释放的 甲酸 (formate) 作为 C1 副产物，通过工程化的甲酸同化通路将其整合回 MTHF，从而恢复生长。

4.2. 核心方法详解 (逐层深入)

4.2.1. 宿主菌株选择与理性分析

本文选择 非致病性土壤细菌 Pseudomonas putida KT2440 的基因组简化衍生物 EM42 作为宿主菌株。选择理由如下：

• 代谢多样性 (versatile metabolism)： 能够利用多种碳源。
• 高毒性耐受性 (high tolerance to toxic substrates and products)： 对于天然产物的生产尤其有利，因为许多天然产物对微生物有毒性。
• 黄素耐受性： Pseudomonas 物种已知对黄素具有耐受性。
• 犬尿酸通路潜力： 假单胞菌 (Pseudomonads) 被报道编码色氨酸 (tryptophan) 到犬尿酸 (kynurenine) 的通路，可作为酶活性的理想来源。
• 二聚化酶潜力： P. putida KT2440 编码四个推定的过氧化氢酶 (catalase)，这些酶已知可催化邻氨基苯酚 (ortho-aminophenol) 向吩恶嗪 (phenoxazine) 的氧化二聚化，类似于 3-羟基犬尿酸 (3-hydroxykynurenine, 3HK) 转化为黄素的过程。

4.2.2. 计算模型辅助设计 MTHF 缺陷型菌株 PUMA

为了建立 MTHF 缺陷型菌株，研究人员首先利用计算模型辅助设计。

• 模型选择： 使用 P. putida 的基因组规模代谢模型 ijN1463 和 gcOpt 算法 (GrowthCoupling-Suite [56]) 进行体内酶选择系统 (in vivo enzyme selection systems) 的生长耦合策略设计。
• 目标设置： gcOpt 算法用于识别基因敲除 (knockout)、异源基因敲入 (heterologous knock-in) 和培养基组成，以将特定反应的活性与细胞生长耦合。本研究将犬尿酸单加氧酶 (kynurenine monooxygenase, KMO) 反应设为目标函数，以特异性计算 3HK 合成通路与生长的耦合策略。
• 基因敲除预测： 模型预测删除 gcuTHP 和 glyA 基因可以建立 MTHF 缺陷型。
  • glyA 基因编码丝氨酸羟甲基转移酶 (serine hydroxymethyltransferase, SHMT)，负责将丝氨酸 (serine) 转化为甘氨酸 (glycine) 并提供 C1 单位给四氢叶酸 (tetrahydrofolate, THF)。
  • gcuTHP 操纵子 (operon) 编码甘氨酸裂解系统 (glycine cleavage system)，负责分解甘氨酸并提供 C1 单位。
  • 通过阻断这两个主要来源，细胞将无法合成 MTHF。
• 甲酸依赖性验证： in silico 预测显示，双缺失菌株对甲酸有严格依赖性，表现为任何给定生长状态下甲酸摄取下限为正。
• 甲酸代谢流预测： 模型预测在 MTHF 缺陷型菌株中，THF 激活的甲酸主要流向嘌呤生物合成（87%），少量流向 L-甲硫氨酸（12%）和嘧啶（1%）生物合成。
• 替代设计评估： 评估了其他实现 MTHF 缺陷型的方法，但 $ΔglyAΔgcuTHP$ 双缺失提供了最强的生长耦合强度和最少的基因删除。

4.2.3. PUMA 菌株的构建与表征

在基因组简化菌株 EM42 中构建了 PUMA 菌株，涉及以下基因操作：

1. 删除 MTHF 生产相关基因： 使用 I-SceI 介导的同源重组和 CRISPR-Cas9 反向筛选，删除 EM42 中 glyA 的两个拷贝 (glyA-I 和 glyA-II) 以及 gcuTHP 的两个操纵子 (gcuTHP-I 和 gcuTHP-II)。
   • 这些删除操作阻断了通过丝氨酸和甘氨酸向 THF 转移 C1 单位的途径，如图 2a 所示。
   • 图 2a 中的红色叉号表示这些被阻断的途径。
2. 插入异源甲酸同化模块： 在 pha 基因座（编码聚羟基脂肪酸酯 (polyhydroxyalkanoate) 生物合成，以避免其作为碳汇）插入来自 Methylobacterium extorquens 的优化甲酸同化模块。该模块包含三个基因：

   • ftfL (UniProt Q83WSO)：编码甲酸-四氢叶酸连接酶 (formate-THF ligase)，将甲酸直接与 THF 连接。

   • fchA (UniProt Q49135)：编码甲烯基-四氢叶酸环水解酶 (methenyl-THF cyclohydrolase)。

   • mtdA (UniProt P55818)：编码亚甲基-四氢叶酸脱氢酶 (methylene-THF dehydrogenase)。

   • 该模块使得甲酸能够被同化并转化为 MTHF，从而恢复 MTHF 的生物合成（图 2a 中的紫色通路）。

     以下是原文 Figure 2a 的示意图，展示了 MTHF 代谢在 P. putida 中的过程以及 PUMA 菌株的设计：

     该图像是图表，包含了P. putida菌株PUMA的设计与表征。图(a)展示了通过FtfL、FchA和MtdA重建形式酸同化途径的生化反应，涉及MTHF代谢的各个步骤。图(b)呈现了不同底物条件下的细胞密度生长曲线，横轴为时间（小时），纵轴为细胞密度（OD600）。图(c)探讨了形式酸浓度对细胞生长的影响，包含浓度变化的不同样品。 VLM 描述: 该图像是图表，包含了P. putida菌株PUMA的设计与表征。图(a)展示了通过FtfL、FchA和MtdA重建形式酸同化途径的生化反应，涉及MTHF代谢的各个步骤。图(b)呈现了不同底物条件下的细胞密度生长曲线，横轴为时间（小时），纵轴为细胞密度（OD600）。图(c)探讨了形式酸浓度对细胞生长的影响，包含浓度变化的不同样品。 原始论文描述: Fig. 2 | Design and characterization of PUMA. a, MTHF metabolism in P. putida involves the transfer of C1 units to THF from serine and glycine, both of which were blocked in the PUMA strain as indicated by the red crosses. Engineering a formate assimilation pathway through FtfL, FchA and MtdA of M. extorquens (purple) restores MTHF biosynthesis from formate. b, A growth plot of the PUMA strain in MSM containing glucose $2 0 \\mathsf { m M }$ in the absence or presence of formate Time (h)

• 表征结果：
  • PUMA 菌株在仅以葡萄糖为碳源时无法生长，证实了其 C1 缺陷型 (C1 auxotrophy)。
  • 在葡萄糖和外源甲酸存在下，PUMA 表现出适度生长。
  • 加入外源甘氨酸后，PUMA 菌株的生长得到显著恢复（图 2b），并且生长速率和最大细胞密度与甲酸浓度呈正相关（图 2c）。这表明甘氨酸水平限制了生长，而通过 L-苏氨酸醛缩酶 (L-threonine aldolase, LtaE) 的内源途径不足以补偿 glyA 缺失导致的甘氨酸不足。

4.2.4. 犬尿酸生物合成通路与生长耦合

为了测试内源产生的甲酸是否能够恢复生长并同时促进异源生物合成，研究人员选择了犬尿酸通路。

1. 犬尿酸通路特点： 该通路将色氨酸 (L-tryptophan, Trp) 的 C2 碳原子氧化移除，以甲酸 (formate) 形式释放（图 3a）。
2. 基因来源： 从 Pseudomonas sp. DTU12.1 中获取犬尿酸生物合成基因簇 (qbs) 相关的基因。
3. 构建表达质粒： 构建了两个基于质粒的通路，用于合成 L-犬尿酸 (L-kynurenine, Kyn) 和 3HK (3-hydroxykynurenine)。基因置于合成型组成型 $σ70$ 启动子 P_EM7 的控制下。

   • Kyn 生产通路 (pS4413-qbsFH)： 包含 qbsF（色氨酸2,3-双加氧酶, tryptophan 2,3-dioxygenase, TDO）和 qbsH（犬尿酸甲酰胺酶, kynurenine formamidase, KFA）。TDO 将 Trp 氧化为 N-甲酰基犬尿酸，KFA 将其水解为 Kyn，并释放甲酸。

   • 3HK 生产通路 (pS4413-qbsFGH)： 在 Kyn 通路基础上额外包含 qbsG（犬尿酸单加氧酶, kynurenine monooxygenase, KMO）。KMO 将 Kyn 转化为 3HK。

   • 图 3a 描述了该生物合成通路，其中甲酸作为副产物释放。

     以下是原文 Figure 3a 的示意图，展示了犬尿酸生物合成通路以及甲酸的释放：

     该图像是示意图，展示了动物色素黄藻素的微生物合成路径，包括催化反应和不同化合物的转化。图中标识了关键反应步骤及相关产物，如L-色氨酸到黄藻素的转化过程以及与细菌生长相关的反馈机制。 VLM 描述: 该图像是示意图，展示了动物色素黄藻素的微生物合成路径，包括催化反应和不同化合物的转化。图中标识了关键反应步骤及相关产物，如L-色氨酸到黄藻素的转化过程以及与细菌生长相关的反馈机制。

• 生长验证与产物检测：
  • 将 qbsFH 质粒导入 MTHF 缺陷型菌株 PUMA，得到 PUMA-Kyn。该菌株在没有外源甲酸的情况下，能够通过 Trp 维持生长，但 PUMA 菌株不能（图 3c），表明 MTHF 生物合成确实由犬尿酸通路提供支持。
  • 更高浓度的外源 Trp 导致更快的生长速率和更高的最大细胞密度（图 3d），并过量生产 Kyn 和犬尿酸 (kynurenic acid, KYNA)。
  • PUMA-Kyn 菌株的 Kyn 和 KYNA 产量比亲本 EM42 菌株（EM42-Kyn）高出 45 倍（图 3f）。
  • 将 qbsFGH 质粒导入 PUMA，得到 PUMA-Xa。该菌株也依赖 Trp 和甘氨酸生长（图 3c, d）。
  • PUMA-Xa 生产 3HK、KYNA、Kyn 和黄尿酸 (xanthurenic acid, XANA) 等，且产量远高于 EM42 菌株（EM42-Xa）（图 3e, f）。
  • PUMA-Xa 在生长过程中出现明显的颜色变化（黄色到橙色），而 EM42-Xa 没有（图 3h）。
  • HPLC-MS 分析揭示 PUMA-Xa 上清液中形成两种新化合物，其吸收光谱（图 3g）和质量与 3HK 衍生的二聚体黄素 (Xa) 和脱羧黄素 (decarboxylated Xa, DC-Xa) 一致，总产量为 $154.3 \pm 11.6 \text{ mg L}^{-1}$。

4.2.5. 自适应实验室进化 (Adaptive Laboratory Evolution, ALE)

为了优化生长耦合的眼色素生物合成，使菌株不再依赖外源补充的甘氨酸和色氨酸，研究人员进行了两轮 ALE。

1. 甘氨酸依赖性解除：

   • 将 PUMA 菌株进行 ALE，以选择能够在没有外源甘氨酸的情况下生长的菌株。

   • ALE 采用自动化平台和动态减少补充物浓度的方法。

   • 结果： 意外发现所有八个独立的 ALE 实验都显示，在没有甘氨酸的情况下持续生长。分析表明，metK 基因（编码 S-腺苷-L-甲硫氨酸合酶, S-adenosyl-L-methionine synthase, SAM）出现点突变，且发生在不同序列位置（图 4b）。这提示 metK 活性在甘氨酸代谢中具有意想不到的作用。通过将特定的 MetK 突变（R281H 和 P237T）重新工程化到 PUMA 菌株中，证实了 MetK 在解除甘氨酸依赖性中的作用。

   • 通过 ONT 测序分析了进化群体的 metK 突变频率，发现了多种突变形式（图 4c, d）。

     以下是原文 Figure 4a-d 的示意图，展示了甘氨酸依赖性解除的 ALE 过程及 metK 突变：

     该图像是图表，展示了经过选择的微生物菌株在不同氨基酸浓度下的生长曲线及其代谢工程过程。图中包含生长密度随时间的变化，以及不同突变体的比较。部分插图展示了基因片段的变化，标注了插入和缺失的区域。 VLM 描述: 该图像是图表，展示了经过选择的微生物菌株在不同氨基酸浓度下的生长曲线及其代谢工程过程。图中包含生长密度随时间的变化，以及不同突变体的比较。部分插图展示了基因片段的变化，标注了插入和缺失的区域。 原始论文描述: Fig. 4 | ALE to select for an ommochrome production strain with glucose as the sole carbon source. a, A representative plot ofgrowth during passaging to remove glycine auxotrophy. Serial batch passaging was performed with a robotic platform using a process controlled weaning protocol67. Cells were grown in MSM medium containing glucose ( $2 0 \\mathsf { m M }$ and formate $( 1 0 \\mathsf { m M } )$ with supplementation of glycine as indicated. b, A growth plot of evolved clones with various MetK mutants. Evolved clones, but not the parental strain, were able to grow in MSM containing glucose and formate without glycine. c, A plot

2. 色氨酸依赖性解除：

   • 将 Kyn (qbsFH) 和 3HK (qbsFGH) 表达质粒转移到解除甘氨酸依赖性的进化群体（ePUMA），分别生成 ePUMA-Kyn 和 ePUMA-Xa。
   • 进行了第二轮 ALE，以解除色氨酸依赖性。
   • 结果： ePUMA-Kyn 和 ePUMA-Xa 的色氨酸依赖性迅速解除（图 4e, f）。全基因组测序显示，没有共同的基因组突变。然而，所有通路质粒都在 P_EM7 启动子区域发生突变，包括缺失 (deletion)、插入重复 (insertional repeats) 和单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymorphisms, SNPs)（图 4g）。这表明菌株通过调节基因表达水平来适应色氨酸需求。将这些突变的启动子序列重新引入 PUMA 和 ePUMA 菌株，发现足以赋予色氨酸独立生长能力。

4.2.6. $^{13}$C 同位素示踪 (Isotope Tracing)

为了确认甲酸完全来源于色氨酸并恢复生长，对 ePUMA-Xa(Win) 菌株进行了 $^{13}$C 同位素示踪实验。

• 示踪碳源： 喂养 $[2-^{13}\text{C}_1]$-葡萄糖。葡萄糖的 C2 碳原子将标记色氨酸吲哚环的 C2，进而通过 TDO (qbsF) 和 KFA (qbsH) 活性产生 $[^{13}\text{C}]$-甲酸。
• 分析对象： 氨基酸池。
• 结果：
  • 与野生型 EM42 相比，ePUMA-Xa(Win) 在组氨酸 (histidine) 中观察到差异标记富集，组氨酸的 C2 碳来源于 10-甲酰基-THF (10-formyl-THF)（图 6）。这与代谢流模拟结果一致，表明 Trp 衍生的甲酸被同化为 10-甲酰基-THF，进而合成组氨酸。
  • 在甲硫氨酸的甲基组中未检测到富集，推测 metK 突变可能允许一种不依赖 10-甲酰基-THF 还原为 5-甲基-THF 的甲硫氨酸代谢途径。
  • 在甘氨酸、酪氨酸 (tyrosine) 和苯丙氨酸 (phenylalanine) 中观察到清晰的标记富集，丝氨酸 (serine) 中适度富集。甘氨酸的标记富集验证了 glyA 删除后，甘氨酸合成途径的改变，即甘氨酸现在来源于苏氨酸（被标记）。酪氨酸和苯丙氨酸的标记增加，以及丝氨酸的标记增加，表明进化菌株为了满足色氨酸需求，重新调整了中心碳代谢的通量，可能上调了糖异生 (gluconeogenesis) 途径。

4.2.7. 补料分批生产与化学分析 (Fed-batch Production and Chemical Analysis)

1. 摇瓶时间进程研究：
   • 在仅以葡萄糖为碳源的摇瓶培养中，ePUMA-Kyn(Win) 生产的 Kyn 和 KYNA 产量与未进化的 PUMA-Kyn 相当，且不再需要甘氨酸和色氨酸补充。
   • ePUMA-Xa(Win) 菌株的代谢谱发生有益转变，3HK 相对于 KYNA 的产量增加。它能够在仅以葡萄糖为碳源时生产黄素，而 EM42-Xa 即使补充色氨酸也无法生产。
   • ePUMA-Xa(Win) 生产的其他单体代谢物（Kyn, KYNA, 3HK, XANA）产量是 EM42-Xa 的 10-30 倍。
2. 生物反应器补料分批生产：
   • 在 250 mL 生物反应器中进行补料分批培养，持续 72 小时向 ePUMA-Xa(Win) 喂入 34 g 葡萄糖，得到浓稠的深红色培养液。
   • 上清液经抗坏血酸 (ascorbic acid) 处理后沉淀出黄素。还原态黄素和脱羧黄素 (DC-Xa) 从水溶液中沉淀出来，而犬尿酸类单体仍留在溶液中，提供了一种简便的纯化途径。
   • 从 230 mL 培养液中获得了 551 mg 粗黄素粉末，计算产量为 $2.4 \text{ g L}^{-1}$。
3. 黄素光电特性分析：

   • 通过 UV-Vis 吸收光谱、氧化还原依赖的颜色变化和循环伏安法 (cyclic voltammetry) 评估生物合成黄素的性能。

   • UV-Vis 光谱显示生物合成黄素的可见光带相对于合成黄素红移（从 435 nm 到 470 nm）。

   • 两种制备物都表现出黄素固有的氧化还原依赖性颜色变化（黄到红），与之前的合成黄素报告一致。

   • 循环伏安法证实了可逆的电子转移。

   • 从 Tauc 曲线推断的光学和基本能带隙 (energy bandgaps) 显示，生物合成黄素与合成黄素高度相似，证实了这种生物材料的稳定生产。

     以下是原文 Figure 5 的示意图，展示了黄素的纯化和光电特性分析：

     该图像是图表，展示了生物合成的Xa在不同条件下的光电特性分析。图中包含Xa的提取流程、UV-Vis吸收光谱比较、红氧化还原状态的颜色变化、循环伏安曲线和能量带隙比较，涵盖了合成和生物合成Xa的对比结果。 VLM 描述: 该图像是图表，展示了生物合成的Xa在不同条件下的光电特性分析。图中包含Xa的提取流程、UV-Vis吸收光谱比较、红氧化还原状态的颜色变化、循环伏安曲线和循环伏安曲线和能带隙比较，涵盖了合成和生物合成Xa的对比结果。 原始论文描述: Fig. 5 | Analysis of optoelectronic properties ofXa. a, Purification of Xa from shake-flask cultures of strain ePUMA-Xa(Win). Addition of ascorbate to aqueous supernatant causes precipitation of an Xa-based pellet. The other kynureninebased monomers remain in solution. b, Comparison of UVvis absorbance spectra in DMSO. c, Image of redox-dependent color change associated with the oxidized (yellow) and reduced (red) forms of the chemically synthesized and biosynthesized Xa. d, Cyclic voltammetry curves of each compound $( 0 . 5 \\mathrm { m g } \\mathrm { m l ^ { - 1 } } ,$ in DMSO containing O.1 M lithium triflate. e, Comparison of optical and fundamental energy bandgaps and associated HOMO and LUMO levels extrapolated from Tauc plots generated from the absorption data and values extrapolated from cyclic voltammetry curves, respectively.

5. 实验设置

5.1. 数据集

实验中使用的主要“数据集”是经过基因工程改造的微生物菌株和特定的培养基。

• 细菌菌株：
  • 克隆宿主 (Cloning Host)： E. coli DH5α 和 E. coli DH5α λpir。
  • 亲本菌株 (Parental Strain)： Pseudomonas putida EM42 (KT2440 的基因组简化衍生物)。
  • 工程菌株 (Engineered Strains)：
    • PUMA： EM42 的 MTHF 缺陷型衍生物（ΔglyA-I, ΔglyA-II, ΔgcuTHP-I, ΔgcuTHP-II，并插入甲酸同化模块 ftfL-fchA-mtdA）。
    • PUMA-Kyn： PUMA 转化 qbsFH 表达质粒（生产 Kyn）。
    • PUMA-Xa： PUMA 转化 qbsFGH 表达质粒（生产 3HK 和 Xa）。
    • ePUMA： 经过 ALE 进化的甘氨酸独立 PUMA 菌株。
    • ePUMA-Kyn(Win)： ePUMA 转化 qbsFH 表达质粒并经过 ALE 进化的色氨酸独立菌株。
    • ePUMA-Xa(Win)： ePUMA 转化 qbsFGH 表达质粒并经过 ALE 进化的色氨酸独立菌株。
    • 对比菌株： EM42-Kyn (EM42 转化 qbsFH)，EM42-Xa (EM42 转化 qbsFGH)。
  • 基因来源： 犬尿酸生物合成基因簇 (qbs) 来自 Pseudomonas sp. DTU12.1。甲酸同化模块来自 Methylobacterium extorquens。
• 培养条件：
  • 通用培养基： LB 培养基用于常规培养 E. coli 和 P. putida。
  • 最小盐培养基 (Minimal Salt Medium, MSM)： 用于生长测定、生物生产测定和 ALE 实验。MSM 组成为 $3.88 \text{ g L}^{-1} \text{K}_2\text{HPO}_4$, $1.63 \text{ g L}^{-1} \text{NaH}_2\text{PO}_4$ 和 $2 \text{ g L}^{-1} (\text{NH}_4)_2\text{SO}_4$，补充微量元素和 $3.6 \text{ g L}^{-1} (20 \text{ mM})$ 葡萄糖。
  • 补充物： 根据实验需要添加甘氨酸 (glycine)、甲酸 (formate) 和色氨酸 (L-tryptophan, Trp)。
  • 抗生素： 卡那霉素 (kanamycin, $50 \mu\text{g ml}^{-1}$)，庆大霉素 (gentamicin, $10 \mu\text{g ml}^{-1}$)，链霉素 (streptomycin, $100 \mu\text{g ml}^{-1}$)。
  • 温度： E. coli $37^\circ\text{C}$，P. putida $30^\circ\text{C}$。
  • 发酵条件： 补料分批培养在 250 mL 生物反应器中进行，连续喂入葡萄糖，pH 调节，搅拌速率控制。
• 为什么选择这些“数据集”：
  • P. putida 是代谢工程的平台宿主，具有良好的生物安全性和对产物的耐受性，适合异源生产。
  • MSM 配合特定补充物，能够精确控制营养条件，用于验证缺陷型菌株的生长依赖性，并筛选进化菌株。
  • Pseudomonas sp. DTU12.1 提供了理想的犬尿酸通路基因，而 Methylobacterium extorquens 提供了高效的甲酸同化通路，两者与宿主菌株的代谢兼容。

5.2. 评估指标

对论文中出现的每一个评估指标，进行以下说明：

5.2.1. 细胞密度 (Cell Density)

• 概念定义： 衡量微生物在液体培养基中的浓度，通常与生物量 (biomass) 成正比。它是评估菌株生长状态、代谢活性和发酵性能的基本指标。
• 数学公式： 通常通过测量培养液的光密度 (Optical Density) 来间接衡量。 $$\text{OD}_{600} = -\log_{10}\left(\frac{I}{I_0}\right)$$ 符号解释：
  • $\text{OD}_{600}$：在 600 nm 波长下测得的光密度。
  • $I$：透过培养液的光强度。
  • $I_0$：透过空白培养基（不含细胞）的光强度。 光密度与细胞浓度在一定范围内呈线性关系。论文中还进行了校准，使得 OD 读数与标准比色皿的 OD 值相关联：$\text{OD}_{\text{cuvette}} = \text{OD}_{\text{plate}} / 0.194$。
• 符号解释：
  • $\text{OD}_{\text{cuvette}}$：校准后的比色皿光密度值。
  • $\text{OD}_{\text{plate}}$：微孔板读数仪测得的光密度值。

5.2.2. 比生长速率 (Specific Growth Rate)

• 概念定义： 单位时间内细胞生物量（或细胞数量）增加的比例，反映了微生物在特定培养条件下的生长速度。它是评估菌株生长性能的重要参数。
• 数学公式： 在指数生长期，比生长速率 ($\mu$) 可以通过以下公式计算： $$\mu = \frac{\ln(\text{OD}_2) - \ln(\text{OD}_1)}{t_2 - t_1}$$ 符号解释：
  • $\mu$：比生长速率 ($h^{-1}$)。
  • $\text{OD}_1$：在时间 $t_1$ 测得的光密度。
  • $\text{OD}_2$：在时间 $t_2$ 测得的光密度。
  • $t_1, t_2$：指数生长期的两个时间点 ($h$)。

5.2.3. 最大细胞密度 (Maximum Cell Density)

• 概念定义： 在给定培养条件下，微生物群体所能达到的最高细胞浓度。它反映了培养基中营养物质的利用效率、产物的耐受性以及代谢网络的整体性能。
• 测量方式： 通常是在培养过程中，当细胞生长达到平台期（stationary phase）时，测量的最高 $\text{OD}_{600}$ 值。

5.2.4. 产物产量 (Product Titer)

• 概念定义： 指单位体积培养液中目标产物的质量，通常以 $\text{mg L}^{-1}$ 或 $\text{g L}^{-1}$ 表示。它是衡量生物生产效率的核心指标。
• 测量方式： 通过高效液相色谱-质谱联用 (HPLC-MS) 对发酵上清液中的目标化合物进行定量。将样品浓度与已知浓度的标准品校准曲线进行比较。

5.2.5. 产率 (Yield, $Y_{\text{P/S}}$)

• 概念定义： 指生产目标产物的质量与消耗底物质量之比，或目标产物的摩尔数与消耗底物摩尔数之比。反映了底物转化为产物的效率。
• 数学公式： $$Y_{\text{P/S}} = \frac{\text{Mass}_{\text{product}}}{\text{Mass}_{\text{substrate}}} \quad \text{或} \quad Y_{\text{P/S}} = \frac{\text{Moles}_{\text{product}}}{\text{Moles}_{\text{substrate}}}$$ 符号解释：
  • $Y_{\text{P/S}}$：产率。
  • $\text{Mass}_{\text{product}}$：生成的产物质量。
  • $\text{Mass}_{\text{substrate}}$：消耗的底物质量。
  • $\text{Moles}_{\text{product}}$：生成的产物摩尔数。
  • $\text{Moles}_{\text{substrate}}$：消耗的底物摩尔数。 本文在计算模型中提及黄素的最大理论产率（1:2 Xa:Kyn）为 $0.231 \text{ mol}$ 黄素每摩尔葡萄糖。

5.2.6. 黄素和脱羧黄素的鉴定 (Xa and DC-Xa Identification)

• 概念定义： 确认发酵产物是否为目标化合物及其衍生物，并对其结构进行确证。
• 测量方式：
  • 高效液相色谱-质谱联用 (HPLC-MS)： 通过保留时间 (retention time)、紫外-可见光 (UV-Vis) 吸收光谱和精确分子量 ($[\text{M}+\text{H}]^{1+}$) 匹配来初步鉴定。
  • 核磁共振 (Nuclear Magnetic Resonance, NMR)： 对纯化后的脱羧黄素 (DC-Xa) 进行一维和二维 NMR 分析，以确证其化学结构。

5.2.7. 光电特性 (Optoelectronic Properties)

• 概念定义： 评估生物合成黄素作为生物材料的物理化学特性，包括其对光的吸收行为、氧化还原活性以及相关的颜色变化。
• 测量方式：
  • 紫外-可见光吸收光谱 (UV-Vis Absorbance Spectra)： 测量黄素对不同波长光的吸收情况，反映其电子结构和颜色。
  • 氧化还原依赖的颜色变化 (Redox-dependent Color Change)： 通过添加氧化剂（如亚硝酸钠）和还原剂（如抗坏血酸）观察黄素在不同氧化态下的颜色变化。
  • 循环伏安法 (Cyclic Voltammetry)： 测量黄素的电化学氧化还原电位，反映其电子转移能力和稳定性。
  • 能带隙 (Energy Bandgaps)： 根据 UV-Vis 吸收数据通过 Tauc 曲线 (Tauc plot) 外推光学能带隙 (optical bandgap) 和基本能带隙 (fundamental energy bandgap)，以及根据循环伏安曲线外推最高占据分子轨道 (HOMO) 和最低未占据分子轨道 (LUMO) 能级。

5.2.8. $^{13}$C 同位素富集 (Carbon-13 Isotope Enrichment)

• 概念定义： 通过喂养含有稳定同位素 $^{13}\text{C}$ 标记的碳源，并分析细胞内代谢产物（如氨基酸）中 $^{13}\text{C}$ 的含量和位置，来追踪特定代谢通路的活性和碳流分布。
• 测量方式： 通过气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 分析水解后的蛋白质氨基酸，并对数据进行积分和自然丰度校正。

5.3. 对比基线

论文将自己的方法与以下基线模型和条件进行了比较：

• 野生型宿主菌株 EM42： 这是所有工程菌株的亲本，代表了未进行任何异源通路或缺陷工程化的基础状态。

• EM42 转化犬尿酸通路质粒的菌株 (EM42-Kyn, EM42-Xa)： 这些菌株在亲本 EM42 中表达犬尿酸生物合成通路，但没有 MTHF 缺陷型和 C1 生长耦合机制。它们用于展示生长耦合策略在提高产量方面的优势。

• PUMA 菌株未转化通路质粒： 用于验证 MTHF 缺陷型的严格性，以及对甲酸和甘氨酸补充的依赖性。

• 化学合成黄素： 作为生物合成黄素的对照，用于比较其光电和电化学特性。

  通过这些对比，论文能够清晰地展示生长耦合策略的有效性、工程菌株的性能提升，以及生物合成产物的质量。

6. 实验结果与分析

6.1. 核心结果分析

6.1.1. PUMA 菌株的 C1 缺陷型验证

• 生长依赖性： PUMA 菌株在仅以葡萄糖为唯一碳源的最小盐培养基 (MSM) 中无法生长，这证实了其 C1 缺陷型，表明内源 C1 代谢物无法补偿这种缺陷。
• 外源补充恢复生长：
  • 在葡萄糖和外源甲酸存在下，PUMA 菌株能适度生长。
  • 当 MSM 中额外补充甘氨酸和甲酸时，PUMA 菌株的生长得到显著恢复（图 2b）。
  • 生长速率和最大细胞密度与甲酸浓度呈正相关，从 $0.6125 \text{ mM}$ 到 $10 \text{ mM}$ 的甲酸浓度，生长速率和最大细胞密度分别增加了 6.4 倍和 8.5 倍（图 2c）。这表明甘氨酸水平是生长限制因素，并且细胞健身度与甲酸浓度成正比。

6.1.2. 犬尿酸生物合成通路缓解 MTHF 缺陷型

• 生长耦合验证：
  • 将犬尿酸生物合成通路 (qbsFH) 导入 PUMA 菌株（PUMA-Kyn），菌株在没有外源甲酸的情况下，能够通过 L-色氨酸 (Trp) 维持生长，而 PUMA 菌株则不能（图 3c）。这明确证明了犬尿酸通路在 Trp 转化为 Kyn 过程中释放的甲酸，成功缓解了 MTHF 缺陷，从而支持了细菌生长。
  • PUMA-Xa 菌株（导入 qbsFGH，生产 3HK）也依赖 Trp 和甘氨酸生长（图 3c, d），进一步支持了这一机制。
• 产物产量提升：
  • PUMA-Kyn 菌株的 Kyn 和犬尿酸 (KYNA) 产量比亲本 EM42 菌株（EM42-Kyn）高出 45 倍（图 3f，Extended Data Fig. 2a, b）。
  • PUMA-Xa 菌株生产 3HK ($43.1 \pm 17.9 \text{ mg L}^{-1}$)、黄尿酸 (XANA, $10.1 \pm 0.9 \text{ mg L}^{-1}$)，以及 Kyn ($29.5 \pm 0.2 \text{ mg L}^{-1}$) 和 KYNA ($58.1 \pm 7.2 \text{ mg L}^{-1}$)，所有化合物的产量均显著高于亲本 EM42-Xa 菌株（图 3f，Extended Data Fig. 2c, d）。
• 黄素生产：
  • PUMA-Xa 菌株在生长过程中观察到明显的颜色变化（黄到橙），而 EM42-Xa 没有（图 3h）。
  • HPLC-MS 分析证实 PUMA-Xa 上清液中形成了黄素 (Xa) 和脱羧黄素 (DC-Xa)，总产量为 $154.3 \pm 11.6 \text{ mg L}^{-1}$（图 3e, f, Extended Data Fig. 2d）。这表明即使没有明确引入黄素合酶，3HK 也可能通过自催化或宿主内源酶（如过氧化氢酶）转化为黄素。

6.1.3. 自适应实验室进化 (ALE) 优化菌株性能

• 甘氨酸独立性进化：
  • ALE 成功使 PUMA 菌株摆脱了外源甘氨酸的需求。
  • 全基因组测序发现，所有独立的 ALE 实验中都出现了 metK 基因（编码 S-腺苷-L-甲硫氨酸合酶, S-adenosyl-L-methionine synthase）的点突变，且发生在不同序列位置（图 4b）。
  • 通过将两个常见的 MetK 突变（R281H 和 P237T）重新工程化到 PUMA 菌株中，证实了 MetK 在解除甘氨酸依赖性中的作用（Extended Data Fig. 3）。这提示 MetK 在甘氨酸代谢中可能存在未知或非预期的作用。
• 色氨酸独立性进化：
  • 对 ePUMA-Kyn 和 ePUMA-Xa 菌株进行 ALE，使其摆脱外源色氨酸需求。
  • 进化菌株迅速获得了色氨酸独立生长能力（图 4e, f）。
  • 令人惊讶的是，全基因组测序显示，解除色氨酸依赖性的突变主要发生在表达质粒的 P_EM7 启动子区域，包括缺失、插入重复和单核苷酸多态性（图 4g, Extended Data Fig. 4）。
  • 将这些突变的启动子序列重新导入 PUMA 和 ePUMA 菌株，发现足以赋予色氨酸独立生长能力（Extended Data Fig. 5），这表明细胞通过改变异源基因的表达水平来适应色氨酸需求，而非通过基因组突变。

6.1.4. $^{13}$C 同位素示踪确认碳流

• 甲酸来源与同化：
  • 喂养 $[2-^{13}\text{C}_1]$-葡萄糖给 ePUMA-Xa(Win) 菌株，在组氨酸中观察到 $^{13}\text{C}$ 标记富集（Extended Data Fig. 6, 7）。组氨酸的 C2 碳来源于 10-甲酰基-THF，这证实了 Trp 衍生的甲酸被同化为 10-甲酰基-THF，进而进入中心代谢。
  • 甲硫氨酸的甲基组中未检测到富集，提示 metK 突变可能导致了一种不依赖 10-甲酰基-THF 还原为 5-甲基-THF 的甲硫氨酸代谢途径。
• 中心碳代谢重定向：
  • 在甘氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸中观察到显著的 $^{13}\text{C}$ 标记富集，丝氨酸中适度富集。
  • 甘氨酸标记增加验证了 glyA 缺失后甘氨酸合成途径的改变（由苏氨酸而非丝氨酸合成）。
  • 酪氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸的标记增加表明，进化菌株为了满足增加的 Trp 需求（Trp 是这些氨基酸的前体），重定向了中心碳代谢流，可能上调了糖异生途径，以确保足够的碳前体供应。

6.1.5. 克级黄素生物生产与性能评估

• 摇瓶生产：
  • ePUMA-Kyn(Win) 菌株在仅以葡萄糖为唯一碳源时，Kyn 和 KYNA 产量达到 $59.8 \pm 6.1 \text{ mg L}^{-1}$ 和 $181.2 \pm 0.8 \text{ mg L}^{-1}$，与未进化的 PUMA-Kyn 相当（Extended Data Fig. 8）。
  • ePUMA-Xa(Win) 菌株生产黄素，其代谢谱发生有利转变，3HK 相对于 KYNA 的比例增加。在仅以葡萄糖为碳源时，ePUMA-Xa(Win) 能生产黄素，而 EM42-Xa 即使补充 Trp 也不能。
  • ePUMA-Xa(Win) 生产的其他单体代谢物（Kyn, KYNA, 3HK, XANA）产量是 EM42-Xa 的 10-30 倍。
• 补料分批生产：
  • 在 250 mL 生物反应器中，ePUMA-Xa(Win) 菌株经过 72 小时补料分批培养，从葡萄糖生产了克级（$2.4 \text{ g L}^{-1}$）粗黄素粉末（Extended Data Fig. 9）。
  • 采用抗坏血酸沉淀法，简化了黄素的纯化过程。
• 黄素光电特性：
  • 生物合成黄素的 UV-Vis 吸收光谱与合成黄素相似，尽管可见光带略有红移。
  • 两种黄素都表现出氧化还原依赖的颜色变化（图 5c）。
  • 循环伏安法证实了生物合成黄素的可逆电子转移，与合成黄素一致（图 5d）。
  • 从 Tauc 曲线推断的光学和基本能带隙，以及 HOMO/LUMO 能级，都显示生物合成黄素与合成黄素高度相似（图 5e）。这表明生物合成的黄素在光电性能方面与化学合成的黄素相当，具有作为生物材料的巨大潜力。

6.2. 数据呈现 (表格)

以下是原文 Extended Data Fig. 7 的表格结果，展示了 EM42-Xa 和 ePUMA-Xa(Win) 菌株在葡萄糖作为唯一碳源培养下氨基酸池的 $^{13}$C 标记富集百分比。

VLM 描述: 该图像是示意图，展示了不同氨基酸（如丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸等）的比例变化。每个图表中，各个氨基酸的比例以不同颜色显示，表明在不同处理下的分布情况。 原始论文描述: experiments are averages from two biological replicates $( \boldsymbol { \mathsf { n } } = 2 )$ samples harvested at the end of exponential growth. In all cases standard deviations were ${ \leq } 0 . 9 6 \%$ .

从表格数据可以看出，ePUMA-Xa(Win) 菌株在甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸的 $^{13}\text{C}$ 标记富集程度显著高于 EM42-Xa。这支持了 $^{13}\text{C}$ 同位素示踪分析中关于甘氨酸合成途径改变、以及中心碳代谢流重定向以满足色氨酸需求和叶酸循环的结论。特别是组氨酸的标记富集，明确证实了 Trp 衍生的甲酸被同化并进入 10-甲酰基-THF 路径。

6.3. 消融实验/参数分析

论文中没有明确地以“消融实验”的标题呈现，但 ALE 过程本身可以看作是一种通过“进化选择”进行的消融实验和参数分析，它揭示了：

• 基因组与质粒突变对生长的影响：
  • MetK 突变： 在解除甘氨酸依赖性的 ALE 中，metK 基因的突变是反复出现的，且将这些突变重新引入 PUMA 菌株可以恢复甘氨酸独立生长。这验证了 MetK 在甘氨酸代谢（或相关通路）中的关键作用。
  • P_EM7 启动子突变： 在解除色氨酸依赖性的 ALE 中，表达质粒上 P_EM7 启动子区域的突变是关键。这些突变通过调节异源基因的表达水平（例如，可能提高了 qbs 基因的表达，从而增加了甲酸的生成，或者降低了表达以减少代谢负担）来缓解色氨酸依赖性。这表明在生长耦合系统中，调节基因表达水平与基因组突变一样，是微生物适应和优化的重要机制。
• Trp 浓度对生长的影响： 论文通过图 3d 展示了外源 Trp 浓度对 PUMA-Kyn 和 PUMA-Xa 菌株生长速率和最大细胞密度的影响，高浓度 Trp 能加速生长。这说明了生长耦合对前体浓度的敏感性。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本文成功地开发并验证了一种新颖的生长耦合生物合成策略 (growth-coupled biosynthetic strategy)，用于在微生物细胞工厂中高效生产结构复杂的动物色素黄素 (xanthommatin)。通过在 Pseudomonas putida 中工程化一个 5,10-亚甲基四氢叶酸 (MTHF) 缺陷型菌株 PUMA，并利用异源犬尿酸 (kynurenine) 生物合成通路在转化色氨酸 (L-tryptophan) 过程中释放的甲酸 (formate) 来缓解该缺陷，实现了目标产物黄素的生产与细菌生长的直接耦合。这种设计将通常为次级代谢产物的黄素转化为工程菌株的“初级代谢产物”。

通过自适应实验室进化 (ALE)，研究人员进一步优化了菌株，成功解除了对甘氨酸 (glycine) 和色氨酸的额外补充依赖，使其能够在仅以葡萄糖为唯一碳源的条件下高效生产。ALE 过程揭示了 metK 基因的突变在解除甘氨酸依赖性中的非预期作用，以及 P_EM7 启动子区域的突变在解除色氨酸依赖性中的关键作用，强调了进化在优化生物合成系统中的强大且无偏见的力量。最终，工程菌株 ePUMA-Xa(Win) 在补料分批培养中实现了克级 (2.4 g/L) 的黄素生产，并且生物合成的黄素在光电和电化学特性上与化学合成的黄素高度相似。

这项工作不仅为黄素的规模化生产提供了可持续途径，还确立了 C1 恢复作为一种通用、即插即用 (plug-and-play) 的生物合成方法，有望加速其他在合成过程中释放 C1 分子的天然产物的工程化生产。

7.2. 局限性与未来工作

论文作者指出了以下局限性并提出了未来工作方向：

• metK 突变与甘氨酸代谢的联系： 仍需进行额外的实验来深入理解 P. putida 中 metK 突变如何与甘氨酸生物合成关联。这是一个意外的发现，其机制尚不明确。
• 黄素二聚化酶的识别与过表达： 尽管 PUMA-Xa 菌株能够生产黄素，但其 3HK 的转化效率仍有提升空间（收获时仍有 $<50\%$ 的 3HK 底物）。未来可以进一步研究并过表达专用的二聚化酶 (dimerases)（如动物来源的酶或假单胞菌中未识别的酶，如过氧化氢酶或漆酶），以提高 3HK 到黄素的转化率。
• 更长期的 ALE 实验： 可以通过更长期的 ALE 实验，进一步提高菌株的生长速率和生物量产量。
• 代谢通路优化： 移除将代谢流从生产通路中引走的内源代谢通路，以提高产率。
• 发酵条件优化： 优化生物反应器发酵条件，以最大化生产。
• 增加菌株的甲酸需求： 进一步基因组改造，增加菌株对甲酸的需求，理论上可能进一步提高生产潜力。然而，这也可能面临 C1 缺陷型细胞对 C1 单位存在最大需求上限的问题，达到上限后，通路的活性可能饱和，从而限制其生产潜力。
• 计算模型指导设计： 可以进行额外的计算模拟，设计需要更多生物量从 C1 通路产生的菌株。
• 推广到其他 C1 释放通路： 除了黄素，犬尿酸通路还可用于生产其他分子多样性化合物，如调味剂邻氨基苯甲酸甲酯 (methyl anthranilate)、抗抑郁药物前体 4-氯犬尿酸 (4-chlorokynurenine) 以及一系列基于邻氨基苯甲酸的生物活性生物碱 (alkaloids)。本文提出的 C1 生长耦合策略有望加速这些生物可持续材料和天然产物分子的过量生产。

7.3. 个人启发与批判

• 创新性的生长耦合范式： 本文最令人振奋之处在于其对生长耦合策略的创新性应用。通过将异源通路产生的代谢副产物（C1 单元）直接作为宿主生长的救命稻草，它解决了传统生长耦合的两个核心痛点：一是将生长与非核心前体而非最终产物耦合的问题；二是如何实现策略的普适性。这种“以废养生，以生促产”的理念非常巧妙。
• ALE 的强大与“盲区”探索： ALE 的应用不仅优化了菌株，更重要的是揭示了 metK 在甘氨酸代谢中意想不到的作用，以及 P_EM7 启动子突变对表达调控的贡献。这提醒我们，理性设计与非理性进化相结合，能够突破当前认知，发现新的生物学机制和优化途径。对于初学者来说，这强调了即使是看似“旁路”或“不直接相关”的基因，也可能在复杂的代谢网络中发挥关键作用。
• 解决工业痛点： 对于黄素这种具有广泛应用前景但获取困难的生物材料，实现克级生产是一个重大突破。这为功能性化妆品、光电子器件、热管理涂层、传感器和可变色显示器等应用打开了大门，也提供了可持续替代传统提取和化学合成的方法。
• 潜在局限与平衡： 尽管 C1 策略具有普适性，但也存在潜在的局限。论文中提到，C1 缺陷型细胞对 C1 单位的需求可能存在上限，这可能限制了产物的最大生产潜力。未来的研究可能需要在“生长耦合强度”与“最大生产能力”之间找到一个平衡点，可能通过多 C1 来源或更精细的代谢工程来突破这一瓶颈。
• 对其他领域的启示： 这种利用代谢副产物驱动生长的策略，不仅限于 C1 分子。理论上，任何在目标产物合成过程中稳定释放的、且能被宿主再利用以缓解其特定营养缺陷的代谢物，都可以作为生长耦合的媒介。这为合成生物学中复杂分子的高效生产提供了新的通用设计原则。例如，可以探索利用其他小分子（如某些氨基酸、核苷酸等）作为生长耦合的“信号”。
• 工程设计与自然进化的融合： 本文是一个优秀的例子，展示了如何将精密的基因工程（设计缺陷型、插入异源通路）与强大的自然进化（ALE）相结合，共同解决复杂的生物工程问题。这对于初学者理解现代合成生物学研究的综合性有很好的指导意义。