1. 论文基本信息

1.1. 标题

RNA stability enhancers for durable base-modified mRNA therapeutics (用于持久性碱基修饰mRNA疗法的RNA稳定性增强剂)

1.2. 作者

Soo-Jin Jung, Jenny J. Seo, Sunghan Lee, Seong-In Hyun, Ji-eun Lee, Sojeong Lee, Yeji Lee, Hyeshik Chang, Hyukjin Lee, Jin-Hong Kim & V. Narry Kim。 作者们主要隶属于韩国科学技术院（Institute for Basic Science）和首尔国立大学（Seoul National University）。

1.3. 发表期刊/会议

Nature Biotechnology。 Nature Biotechnology 是一本在生物技术领域享有极高声誉和影响力的同行评审科学期刊，专门发表生物技术及其相关领域的原创研究、评论和观点。该期刊的发表通常代表着该领域的重要突破和前沿进展。

1.4. 发表年份

2025年。

1.5. 摘要

mRNA在体内的稳定性有限是疫苗和治疗领域面临的一个主要挑战。虽然环状RNA（circRNA）或自扩增RNA（saRNA）等替代RNA形式提供了更好的持久性，但这些模式通常存在翻译效率低、修饰不兼容以及制造困难等问题。为了克服这些限制，本研究筛选了196,277个病毒序列，并识别出11个能显著增强mRNA稳定性和翻译的元素。从机制上讲，它们通过招募TENT4来延长聚腺苷酸尾（poly(A) tail），从而阻止去腺苷酸化。其中5个元素与N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine, $m1Ψ$）兼容，后者能提高mRNA的效力并降低免疫原性。一个名为A7的元素在不同细胞类型、递送方法、修饰和编码序列中都表现出特别稳健的性能，使线性mRNA的稳定性与circRNA相当，同时实现了更高的翻译效率。在小鼠肝脏中，含有A7的线性mRNA显示出比circRNA高得多的蛋白质水平，且表达持续超过2周。这些RNA稳定性增强剂（RNA stability enhancers）能够构建强大的线性mRNA平台，结合高且持久的表达、低免疫原性和简便的制造工艺。

1.6. 原文链接

/files/papers/69254c689d22cbc32ec0daa2/paper.pdf 该论文已于2025年11月7日在线发表在 Nature Biotechnology 期刊上。

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

2.1.1. 论文试图解决的核心问题

当前mRNA疫苗和治疗的一个主要挑战是mRNA在体内的有限稳定性，这导致了蛋白质生产的持续时间不足。传统的线性mRNA在进入细胞质后会迅速被降解，主要通过去腺苷酸化（deadenylation）途径。

2.1.2. 为什么这个问题在当前领域是重要的？

mRNA技术在疫苗开发（如COVID-19疫苗）和治疗领域（如基因替代疗法、免疫疗法）展现出巨大潜力。然而，mRNA的稳定性直接影响其效力和持续时间。如果mRNA不能稳定存在并持续翻译目标蛋白，其治疗效果将大打折扣，需要更频繁的给药或更高剂量，从而增加成本和潜在副作用。

2.1.3. 现有研究存在哪些具体的挑战或空白？

1. 替代RNA形式的局限性： 环状RNA (circRNA) 或自扩增RNA (saRNA) 虽然具有更好的持久性，但它们各有缺陷：
   • circRNA：通常翻译效率低，环化程序复杂，且内部核糖体进入位点（IRES）与碱基修饰不兼容。
   • saRNA：在细胞内复制会产生双链RNA（dsRNA）中间体，触发先天免疫反应，引发安全担忧。
2. 碱基修饰的兼容性问题： 碱基修饰（如$m1Ψ$）对于降低免疫原性、提高mRNA效力至关重要。然而，许多已知的UTR（Untranslated Region，非翻译区）元件在$m1Ψ$修饰的mRNA背景下会丧失活性。
3. 筛选方法的局限性： 之前的筛选工作受限于病毒多样性不足和基因组覆盖不全，且识别出的稳定元件通常与碱基修饰不兼容，限制了其在治疗中的应用。
4. 制造复杂性： 一些化学修饰的mRNA（如3'端阻断基团、分支帽、多个poly(A) tail）虽然能增加稳定性，但大规模制造可能面临挑战。

2.1.4. 这篇论文的切入点或创新思路是什么？

本论文的创新点在于：

1. 大规模系统性筛选： 首次对超过19.6万个病毒序列进行大规模筛选，以寻找能增强$m1Ψ$修饰mRNA稳定性和翻译的元件，极大地扩展了筛选的广度和深度。
2. 聚焦碱基修饰兼容性： 将$m1Ψ$兼容性作为筛选的核心标准，直接解决了现有UTR元件与治疗性mRNA修饰不兼容的痛点。
3. 发现TENT4依赖机制： 揭示了所识别的稳定元件（包括A7）通过招募TENT4酶来延长poly(A) tail，从而增强mRNA稳定性。
4. 识别独特元件A7： 发现A7这个独特元件，它在不同细胞类型、递送方法、修饰和编码序列中都表现出卓越的稳健性，使线性mRNA能够达到与circRNA相当的稳定性，同时保持更高的翻译效率。
5. 体内持久性验证： 在小鼠模型中验证了A7能够显著提高线性mRNA的蛋白质表达水平并维持超过2周，证明了其在体内应用的巨大潜力。
6. 简化制造工艺： 通过增强线性mRNA的稳定性，为开发高表达、持久、低免疫原性且易于制造的mRNA疗法提供了简单而强大的解决方案。

2.2. 核心贡献/主要发现

1. 识别11个病毒来源的RNA稳定性增强剂： 通过大规模（196,277个）病毒序列筛选，发现了11个能够显著增强碱基修饰（$m1Ψ$）mRNA稳定性和翻译效率的RNA元件（命名为A1到A11）。
2. 揭示TENT4依赖的混合加尾机制： 所有的增强剂，包括A7，都通过招募TENT4酶来延长poly(A) tail，从而防止去腺苷酸化（deadenylation）。Hire-PAT和纳米孔直接RNA测序（nanopore Direct RNA Sequencing, DRS）证实了这些元件促进了poly(A) tail的延长和混合加尾（mixed tailing）。
3. 区分ZCCHC14依赖性： 大多数含有CNGG基序的元件（如$A1-A6, A8-A11$）依赖于ZCCHC14辅助因子来招募TENT4。而A7是一个例外，它不含CNGG基序，且不依赖ZCCHC14或ZCCHC2，暗示其通过一种尚未识别的TENT4辅助因子起作用。
4. A7表现出卓越的稳健性和通用性：
   • 广谱细胞类型活性： A7在多种细胞类型中（包括HepG2和Jurkat细胞）表现出强大的增强活性。
   • 修饰兼容性： A7不仅与$m1Ψ$兼容，还与m5C（5-甲基胞嘧啶）修饰兼容。
   • 分子环境适应性： A7的活性不受5'UTR、编码序列长度、密码子优化、RNA二级结构、尿苷含量或翻译位置（游离或ER相关核糖体）变化的影响。
5. A7使线性mRNA与circRNA具有可比稳定性但翻译效率更高： 在体外，含有A7的线性mRNA显示出与circRNA相当的半衰期，但蛋白质产量显著高于circRNA（HepG2和HCT116细胞中AUC值分别高5.3倍和5.8倍）。
6. 体内持久表达： 在小鼠模型中，含有A7的线性mRNA导致持续超过2周的蛋白质表达，远超对照线性mRNA和circRNA。
7. 为mRNA疗法提供简单强大平台： 这些RNA稳定性增强剂，特别是A7，为开发结合高表达、持久性、低免疫原性和简单制造工艺的线性mRNA疗法提供了一种新策略，克服了现有替代RNA平台的局限性。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

3.1.1. mRNA (Messenger RNA)

信使RNA (mRNA) 是一种单链核糖核酸分子，负责将DNA中的遗传信息从细胞核传递到细胞质中的核糖体，指导蛋白质合成。在疫苗和治疗中，合成的mRNA（即体外转录，IVT mRNA）被导入细胞，指导细胞产生特定的蛋白质（如病毒抗原、治疗性蛋白）。

3.1.2. 5' Cap (5'帽) 和 Poly(A) Tail (聚腺苷酸尾)

• 5' Cap (5'帽): 位于mRNA分子的5'端，是一种特殊的化学修饰（通常是7-甲基鸟苷），在真核生物mRNA中扮演多重角色。它保护mRNA免受核酸外切酶（exoribonucleases）的降解，并参与启动蛋白质合成（帽依赖性翻译，cap-dependent translation）和mRNA的核输出。
• Poly(A) Tail (聚腺苷酸尾): 位于mRNA分子的3'端，由数百个腺苷酸残基组成。Poly(A) tail对于mRNA的稳定性、翻译效率和核输出至关重要。poly(A)-binding proteins (PABPCs) 会结合poly(A) tail并与EIF4G（真核翻译起始因子4G）相互作用，促进翻译起始。

3.1.3. mRNA降解途径 (mRNA Degradation Pathway) 和 去腺苷酸化 (Deadenylation)

• mRNA降解途径: 细胞内存在多种机制来调控mRNA的寿命和丰度。在细胞质中，主要的mRNA降解途径始于poly(A) tail的缩短。
• Deadenylation (去腺苷酸化): 这是mRNA降解的限速步骤（rate-determining step）。CCR4-NOT复合物是主要的去腺苷酸化酶（deadenylase），它会逐步移除poly(A) tail上的腺苷酸。一旦poly(A) tail缩短到一定阈值（例如小于27个核苷酸），PABPCs就会从poly(A) tail解离，随后触发mRNA的尿苷酸化（uridylation）、脱帽（decapping）和进一步的RNA降解。

3.1.4. 碱基修饰 (Base Modifications)

在IVT mRNA中引入碱基修饰是提高其治疗潜力的关键策略：

• Pseudouridine (Ψ) 和 N1-methylpseudouridine (m1Ψ): 假尿苷 ($Ψ$) 和 N1-甲基假尿苷 ($m1Ψ$) 是最常用的修饰。它们通过多种机制增强mRNA效力并降低免疫原性：
  • 减少dsRNA副产物： IVT过程中可能产生双链RNA (dsRNA) 副产物，这些dsRNA会激活先天免疫传感器（如蛋白激酶R (PKR) 和寡腺苷酸合成酶 (OAS)），导致全局翻译抑制、RNA降解、干扰素（interferon）和炎症细胞因子（inflammatory cytokine）的产生。$Ψ$和$m1Ψ$修饰可以减少dsRNA的形成。
  • 逃避免疫检测： $Ψ$和$m1Ψ$修饰的RNA能够逃避RNase T2介导的裂解，并与TLR7和TLR8（Toll样受体7/8）结合不良，从而降低免疫原性。
  • TRIM25抑制： TRIM25是一种蛋白质，通过N4BP1、KHNYN和ZAP等效应器促进外源RNA降解。碱基修饰有助于阻止TRIM25的激活。
• 5-methylcytidine (m5C) 和 5-methoxyuridine (mo5U): 其他修饰如m5C和mo5U也被用于降低dsRNA副产物和免疫反应。

3.1.5. TENTs (Terminal Nucleotidyltransferases)

末端核苷酸转移酶 (TENTs) 是一类可以在RNA分子3'端添加核苷酸的酶，可以对抗去腺苷酸化。

• TENT4 (TENT4A 和 TENT4B): TENT4酶主要通过掺入腺苷酸残基，偶尔也掺入非腺苷酸残基来延长poly(A) tail。这种产生的混合尾（mixed tail）能够有效抵抗CCR4-NOT复合物的去腺苷酸化，从而增强mRNA稳定性。
• 辅助因子 (Cofactors): TENT4的活性受多种辅助因子的调节，例如：
  • ZCCHC14: 结合CNGG基序，是TENT4的辅助因子，参与在RNA上生成混合尾。
  • ZCCHC2: 另一个TENT4的辅助因子，与不含CNGG基序的Kobuvirus K5元件相互作用。

3.1.6. UTRs (Untranslated Regions)

非翻译区 (UTRs) 是mRNA分子中不编码蛋白质的部分，位于5' Cap和3' poly(A) tail之间。

• 5'UTR (5'非翻译区): 位于翻译起始密码子（AUG）上游。
• 3'UTR (3'非翻译区): 位于翻译终止密码子下游，poly(A) tail上游。 UTRs含有多种顺式作用元件（cis-acting elements）和结合位点，可以招募调节蛋白，从而强烈影响mRNA的稳定性、翻译效率、亚细胞定位和降解。优化UTRs是提高治疗性mRNA性能的重要策略。

3.2. 前人工作

3.2.1. 替代RNA平台

• Circular RNA (circRNA, 环状RNA): circRNA因其环状结构而天然免疫于核酸外切酶（exoribonucleases）的降解，具有更长的半衰期。然而，它们通常存在翻译效率较低、需要复杂环化程序以及内部核糖体进入位点 (IRES) 与碱基修饰不兼容等问题。IRES是一种RNA序列，允许在没有5' Cap的情况下直接在内部起始翻译。
• Self-amplifying RNA (saRNA, 自扩增RNA) 或 Trans-amplifying RNA (taRNA, 反式扩增RNA): 这些平台基于病毒RNA复制子，在细胞内可以自我复制RNA，从而实现蛋白质的持续生产。但是，saRNA在复制过程中会产生双链RNA (dsRNA) 中间体，这会触发宿主细胞的先天免疫反应，导致干扰素（interferon）和炎症细胞因子（inflammatory cytokine）的产生，从而引发潜在的安全担忧。

3.2.2. 合成mRNA的化学修饰

除了碱基修饰，研究人员还尝试通过其他化学修饰来提高mRNA稳定性：

• 3'端阻断基团 (3' end blocking groups): 阻止3'端核酸外切酶的降解。
• 分支帽 (branched caps): 增强5' Cap的保护作用。
• 多个poly(A) tail (multiple poly(A) tails): 延长mRNA的寿命。 尽管这些方法可以增加稳定性，但大规模制造这些复杂修饰的mRNA可能具有挑战性。

3.2.3. UTRs优化

通过优化标准线性mRNA的UTRs，使用天然或合成的UTR序列，可以提高mRNA的稳定性和翻译效率。然而，这种方法的改进通常比较有限。

3.2.4. 病毒元件筛选

先前也有研究尝试从病毒中筛选RNA元件来增强基因表达。例如，本文作者之前的研究（Seo et al., 2023）就鉴定了一些病毒元件。但是，这些早期发现的元件大多与$m1Ψ$等碱基修饰不兼容，这限制了它们在治疗应用中的潜力，因为碱基修饰对于降低免疫原性至关重要。

3.3. 技术演进

mRNA技术从最初的理论研究发展到如今的疫苗和治疗应用，经历了多个关键的技术演进。早期，mRNA的体内应用受到其固有不稳定性和强免疫原性的限制。Katalin Karikó和Drew Weissman等人发现假尿苷 ($Ψ$) 和N1-甲基假尿苷 ($m1Ψ$) 等碱基修饰能显著降低mRNA的免疫原性并提高翻译效率，是mRNA疗法发展的里程碑。此后，研究重心转向如何进一步延长mRNA在体内的持续时间，以实现更持久的治疗效果。UTR优化、poly(A) tail调控以及新型RNA平台（如circRNA、saRNA）的开发都是这一方向的努力。本文的工作代表了mRNA稳定性研究的最新进展，它通过大规模、系统化的筛选，发现了能够与关键碱基修饰兼容的病毒源RNA稳定性增强剂，并揭示了它们通过TENT4介导的poly(A) tail延长机制，从而使得线性mRNA在稳定性上能与circRNA媲美，同时保持了高翻译效率。

3.4. 差异化分析

本研究与相关工作的主要差异化和创新点在于：

1. 兼容碱基修饰： 最大的创新是其筛选出的RNA元件（特别是A7）能够与$m1Ψ$和m5C等碱基修饰兼容。这解决了先前UTR优化和病毒元件筛选中普遍存在的兼容性问题，使得这些增强剂可以直接应用于临床前和临床阶段的治疗性mRNA。
2. 大规模和高通量筛选： 相比于之前有限的病毒多样性和基因组覆盖，本研究筛选了近20万个病毒序列，极大地提高了发现高效稳定元件的可能性。
3. 机制深入： 不仅识别了功能性元件，还深入探究了其作用机制，明确了TENT4介导的poly(A) tail延长和混合加尾是核心机制，并区分了ZCCHC14依赖性。
4. A7的卓越性能： A7元件在多种细胞类型、递送方式和分子背景下（不同5'UTR、CDS、密码子优化、RNA二级结构、尿苷含量、翻译位置）都表现出高度的稳健性和通用性，这是其他已知元件难以比拟的。
5. 与替代平台的优势对比： 本研究表明，含有A7的线性mRNA在稳定性上可以与circRNA匹敌，但翻译效率显著更高，且制造工艺更简单。与saRNA相比，它避免了dsRNA诱导的免疫原性问题，更具安全性。

4. 方法论

本研究旨在通过系统性筛选病毒序列，发现能够增强碱基修饰mRNA稳定性与翻译效率的RNA元件。核心方法包括大规模病毒基因组tile库的构建、分两阶段的荧光和mRNA稳定性筛选、深层诱变分析以揭示结构功能关系、以及详细的机制验证（TENT4依赖性、poly(A) tail延长和混合加尾）。

4.1. 方法原理

研究的核心思想是利用病毒基因组作为RNA稳定性增强元件的宝库，因为病毒为了在宿主细胞中高效复制和表达，往往会演化出能劫持宿主RNA调控机制的RNA元件。通过构建包含大量病毒序列片段的tile库，并在碱基修饰mRNA的背景下进行高通量筛选，可以识别出既能增强稳定性又能兼容治疗性mRNA修饰的元件。随后，通过机制研究揭示这些元件如何通过调控poly(A) tail动态来发挥作用。

4.2. 核心方法详解

4.2.1. 病毒基因组Oligo设计与文库构建

1. 序列来源： 从美国国家生物技术信息中心（NCBI）病毒基因组浏览器获取感染脊椎动物的病毒基因组序列（$n=2,678$，代表1,878种不同病毒）。选择标准包括每个属至少一个代表性病毒，对致病性重要的属（如黄病毒、甲病毒、β冠状病毒等）进行扩展表示。
2. 序列处理：
   • RNA病毒： 使用正义链（positive-sense）的全基因组平铺（whole-genome tiling）。
   • DNA病毒： 使用非编码RNA（noncoding RNAs）和推定的调控区域（putative regulatory regions）。调控区域定义为从每个CDS的3'端到同一基因片段中3'相邻CDS的5'端。如果缺少相邻CDS，则使用最近的PAS（polyadenylation signal）确定边界。若PAS未知，则预测或取终止密码子（stop codon）下游390bp区域。
3. Tile设计： 采用197 nt的滑动窗口（sliding window）和20 nt的步长（step size）设计寡核苷酸（oligos）。为保持序列完整性，遇到AscI或NotI限制性位点时，窗口会在此处终止，下一个片段从同一位置开始。
4. 对照： 包含Saffold virus的K4（对$m1Ψ$修饰mRNA有部分增强作用）和Aichivirus的K5（仅对未修饰mRNA有效）作为阳性对照，以及它们的非功能性突变体（K4m、K5m）和Hepatitis D virus核酶序列作为阴性对照。
5. 文库划分： 将oligos分为两个子集VL1（单链RNA病毒）和VL2（其他病毒），共计196,277个独特的oligos。
6. PCR扩增与克隆： oligos通过PCR扩增并引入AscI和NotI限制性位点。扩增产物消化后，克隆到pmirGLO 3x miR-1或Pa01-pmirGLO-EGFP-3x miR-1载体的3'UTR区域。

4.2.2. 初级筛选：蛋白质输出增强（基于FACS）

1. 细胞准备： 将pPaO1-PhiC31-Pa01-pEF-attB-LSR-BFP-IRES-Hyg质粒与pCMVInt共转染至HEK293T细胞，筛选后获得HEK293TR细胞系，确保每个细胞只插入一个病毒元件。

2. 文库转染与整合： 将VL1和VL2质粒文库池转染至HEK293TR细胞，使用Pa01整合酶系统将病毒元件整合到EGFP基因的3'UTR。报告基因盒（reporter cassette）包含$EF1α$来源的5'UTR、Pa01重组位点、带有三个miR-1靶位点的3'UTR间隔区和SV40 polyadenylation signal (PAS)。

3. FACS富集： 对细胞进行两轮荧光激活细胞分选 (FACS)，严格富集具有高GFP荧光（即蛋白质输出高）的细胞（取最高0-0.5%）。

4. gDNA提取与验证： 从分选后的细胞中提取基因组DNA (gDNA)。K4和K5（未修饰mRNA条件下）的富集得到证实，其非活性突变体未被富集。

   该图像是多个实验结果的组合，包括针对mRNA稳定性的筛选结果和参与因子的相关性分析。图a显示了不同时间点下的荧光素酶活性，图b展示了主要筛选过程，图c和图d提供了不同因子的活性对比，图e则表示了Spearman相关系数的矩阵，图f展示了四组重复实验间的对比情况，图g为稳定元素的分布，图h强调了候选体的验证结果。 Extended Data Fig. 1b 展示了$m1Ψ$修饰mRNA的初级筛选流程。病毒基因组序列被分割成197 nt的oligos，步长为20 nt，共计196,277个oligos。这些oligos被克隆到EGFP质粒的3'UTR中，并通过Pa01整合酶整合到基因组中。FACS分选出荧光信号强度最高的0.5%细胞。来自这些分选细胞的EGFP 3'UTR变异区域（约10,784个）通过PCR扩增，随后克隆到荧光素酶（luciferase）质粒的3'UTR中用于次级筛选。

4.2.3. 次级筛选：m1Ψ-修饰mRNA稳定性（基于IVT和测序）

1. 文库合并与克隆： 将VL1和VL2中富集的病毒片段池化，PCR扩增后插入到荧光素酶 (firefly luciferase) 报告质粒的3'UTR中。K3元件（对修饰mRNA有部分增强作用）也被加入文库。
2. IVT mRNA合成： 使用该质粒文库作为模板，通过体外转录 (IVT) 合成mRNA。IVT过程中，用m1Ψ-5'-三磷酸（m1Ψ-5'-triphosphate）替代尿苷酸，以生成$m1Ψ$修饰的mRNA。mRNA含有β-珠蛋白 (HBB) 5'UTR和A60 3'末端序列。
3. 转染与RNA提取： 将$m1Ψ$修饰mRNA通过脂质纳米颗粒 (LNP) 转染到HCT116细胞中。3小时后更换培养基。在0小时（更换培养基后）和36小时提取总RNA。
4. RT-PCR与测序： 对RNA进行逆转录 (RT)，PCR扩增3'UTR区域，并引入唯一分子索引 (UMI)，然后进行纳米孔测序。
5. 数据分析： 使用DESeq2计算每个元件在$36h/0h$的log2倍数变化（log2 fold change），并进行$P$值调整。
   • log2倍数变化 $= \log_2(\frac{\text{36小时RNA水平}}{\text{0小时RNA水平}})$
   • 富集标准：调整后的$P$值 $< 0.001$ 且 log2倍数变化 $> 0.4$。
   • 结果：1.21%（131个tile）的病毒序列显著增强了$m1Ψ$修饰mRNA的稳定性，形成11个稳定簇（A1到A11）。

4.2.4. 筛选结果验证与优化

1. 构建长短元件： 对每个稳定簇，构建两个荧光素酶编码结构：一个包含197 nt的tile（具有最低$P$值和稳健预测RNA结构），另一个是核心功能基序（minimal functional core）的短片段（A1S到A11S）。
2. 荧光素酶活性检测： 将这些元件集成到mRNA中，测试它们在未修饰和$m1Ψ$修饰mRNA中的荧光素酶表达水平。
   • 结果：A1, A2, A4, A6, A7五个元件在$m1Ψ$修饰mRNA中保留了60%以上的活性，表明其兼容性。大多数短片段（A1S, A4S, A5S, A6S, A7S, A9S, A10S, A11S）表现出与长片段相当或更高的活性。

4.2.5. 深层诱变分析 (Deep Mutagenesis Analysis)

为了理解元件的结构-功能关系，对A1S, A2, A4, A6, A7进行了深层诱变：

1. 突变类型：
   • 单核苷酸替换： 替换每个位置的核苷酸。
   • 单核苷酸或双核苷酸删除： 删除序列中的一个或两个连续核苷酸。
   • 补偿性突变： 替换或删除预测的碱基对（base pairs）以维持配对。
   • 插入： 在CNGGN五联环（pentaloop）中插入核苷酸，以研究环大小的重要性。
   • 双替换： 在环和鼓泡（bulges）中连续两个核苷酸进行双替换，以及CNGGN环的第二个和第五个位置进行双替换，以研究序列特异性。
2. 筛选流程： 合成4,542个突变oligos，克隆到荧光素酶报告基因的3'UTR。合成$m1Ψ$修饰IVT mRNA池，转染HCT116细胞，在0h和36h后通过RNA测序测量突变对稳定性的影响。
3. 结构预测： 基于诱变数据，更准确地预测RNA二级结构，尤其对于A7，其结构与EternaFold预测的不同，更接近分支结构（branched structure）。

   • 结果：A7包含AGACCY基序（内部环，internal loop）和GGGGNARUD基序（茎环2，stem loop 2），这两个基序对其稳定性功能至关重要。其他元件的CNGGN五联环中，特定的C, G, G（1, 3, 4位）核苷酸是关键。

     该图像是图表，展示了不同突变对A7S和A2S元素的影响及其结构特征。图b展示了A7S的突变影响，横轴为全长元件中的位置，纵轴为log₂(36h/0h)比值，点的大小代表调整后的p值。图c呈现了A7的结构和不同突变的log₂(FC)变化。图d和图e类似，分别显示了A2S的突变影响及其结构特征。整体分析揭示了关键的结构与序列特征。 Figure 3 展示了深层诱变分析揭示关键结构和序列特征的流程。

$a$图：诱变流程。包括单核苷酸替换、单/双核苷酸删除、补偿性突变、插入和双替换。oligos克隆到荧光素酶报告基因的3'UTR，然后进行IVT筛选。 $b$图：A7S（$61-197 nt$）单替换突变（上）和1-nt或2-nt删除突变（下）的log2倍数变化（$36h/0h$）影响。水平灰色虚线表示A7S的log2倍数变化。圆圈大小代表调整后的$P$值。 $c$图：A7 RNA二级结构中单替换和1-nt删除的平均log2倍数变化（$36h/0h$）。蓝色线宽度表示log2倍数变化。 $d$图：A2S（$101-177 nt$）单替换突变（上）和1-nt或2-nt删除突变（下）的log2倍数变化（$36h/0h$）影响。 $e$图：A2 RNA二级结构中单替换和1-nt删除的平均log2倍数变化（$36h/0h$）。

4.2.6. 机制验证：TENT4依赖性与混合加尾

1. TENT4抑制剂实验： 使用TENT4抑制剂RG7834及其非活性R-异构体（RO0321）处理细胞。
   • 结果：所有11个元件的增强作用在RG7834处理细胞中均被RG7834抑制，表明它们都依赖于TENT4，即使A7没有CNGG基序。
2. 辅助因子KO细胞系： 在ZCCHC14-敲除（KO）和ZCCHC2-KO细胞中测试元件活性。
   • 结果：所有含CNGG环的元件（$A1-A6, A8-A11$）在ZCCHC14-KO细胞中失活，但在ZCCHC2-KO细胞中功能正常，表明它们严格依赖ZCCHC14。A7在两种KO细胞系中都保持活性，暗示其可能通过未识别的适配蛋白招募TENT4。
3. Hire-PAT (High-resolution poly(A) tail assay)： 测量poly(A) tail长度分布。
   • 原理：mRNA的3'端poly(A) tail通过酵母poly(A)聚合酶（yeast poly(A) polymerase）添加GI tail（鸟苷-肌苷，guanosine-inosine），然后用基因特异性RT引物（gene-specific RT primer）进行逆转录，再通过PCR扩增。通过DNA测序仪进行片段分析（fragment analysis），根据片段长度推断poly(A) tail的长度。
   • 实验：将具有60 nt poly(A) tail的$m1Ψ$修饰mRNA转染到HCT116细胞。
   • 结果：对照mRNA在12h内显著去腺苷酸化。含有病毒元件的mRNA的poly(A) tail被延长，甚至超过原始长度，表明元件促进了poly(A) tail的延长。RG7834抑制剂处理后，poly(A) tail长度缩短。
4. Nanopore Direct RNA Sequencing (DRS) (纳米孔直接RNA测序)： 精确测量poly(A) tail长度和核苷酸组成。

   • 原理：DRS直接测序RNA分子，避免了PCR引入的偏差（PCR可能偏向于短的poly(A) tail）。通过分析离子电流信号，可以识别poly(A) tail的长度和其中的非腺苷酸（nonadenosine）掺入（即混合尾）。

   • 实验：转染$m1Ψ$修饰mRNA（对照、A2、A7）到HCT116细胞，12h后进行DRS。

   • 结果：对照RNA的poly(A) tail缩短（中位数38 nt），而A2和A7 RNA的poly(A) tail显著延长（中位数分别为163 nt和91 nt）。RG7834处理后，这些延长现象被消除。离子电流信号分析显示，A2和A7 mRNA的poly(A) tail中掺入了非腺苷酸，证实了混合加尾，且这种现象在RG7834处理后消失。

     该图像是多幅图表，展示了不同 RNA 元素对荧光素酶活性的影响及其 mRNA 稳定性。图 a 和 e 详细说明了在 96 小时内的荧光素酶活性，图 c 和 g 则比较了各种 RNA 处理条件下的信号强度。图 d 展示了不同 RNA 元素的尾部长度分布，图 h 说明了含有 CNGG 动机的元件与 mRNA 稳定性之间的关系。 Figure 4 展示了病毒RNA稳定性增强剂通过TENT4依赖的混合加尾作用。

$a$图：在HCT116亲本细胞和ZCCHC14-KO细胞中，$A$元件$m1Ψ$修饰荧光素酶mRNA在RO0321或RG7834（100 nM）存在下的荧光素酶活性。所有11个测试元件的增强效果在RG7834处理的细胞中被抑制。所有含有CNGG环的元件（A1, A2, A3, A4, A5, A6, A8, A9, A10, A11）在ZCCHC14-KO细胞中失活。 $c$图：通过Hire-PAT测量$m1Ψ$修饰mRNA的poly(A) tail分布。HCT116细胞电穿孔后，与TENT4抑制剂RG7834（100 nM）孵育12h。含有病毒元件的mRNA的poly(A) tail被延长。 $d$图：纳米孔DRS分析poly(A) tail长度。HCT116细胞转染1 µg电穿孔IVT mRNA（对照、A2和A7）后12h。A2和A7报告基因显示出延长的poly(A) tail。 $e$图：在HeLa亲本细胞和ZCCHC2-KO细胞中，$A$元件$m1Ψ$修饰荧光素酶mRNA在RO0321或RG7834（100 nM）存在下的荧光素酶活性。A7在两种KO细胞系中都保持活性。 $g$图：在HCT116亲本细胞和ZCCHC14-KO细胞中，通过Hire-PAT测量$m1Ψ$修饰mRNA的poly(A) tail分布。对于除A7以外的所有测试元件，亲本细胞中的poly(A) tail延长在ZCCHC14-KO细胞中被消除。 $h$图：$A$元件通过TENT4延长poly(A) tail的稳定机制图。所有$A$元件都通过ZCCHC14-TENT4``混合加尾复合物延长poly(A) tail，而A7则通过TENT4和未识别的辅助因子延长poly(A) tail。

4.2.7. 跨细胞类型和分子背景的活性评估

1. 多细胞类型测试： 在HepG2（肝细胞）、A549（肺上皮细胞）、MCF7（乳腺癌）、THP1（单核细胞）、Jurkat（T细胞）和HeLa（宫颈癌）细胞中评估元件活性。
   • 结果：A2和A7在多种细胞类型中显示出最强和最广泛的活性。A7在除THP1外的所有测试细胞系中都表现出稳健活性。
2. 兼容性测试：
   • m5C修饰： 测试元件与5-甲基胞嘧啶 (m5C) 修饰的兼容性。
     • 结果：只有A7S在m5C修饰下仍然具有功能。
   • 不同5'UTR： 使用COVID-19疫苗mRNA-1273的5'UTR（5'-1273）和HBA 3'UTR的对照mRNA。
     • 结果：A7S显著延长了d2EGFP（短半衰期GFP）信号的持续时间。
   • 不同CDS和密码子优化： 使用流感病毒$A$的血凝素 (HA) 基因，并应用不同的密码子优化策略（iCodon、LinearDesign）来生成具有不同核苷酸组成的CDS。
     • 结果：在所有七种测试的CDS中，A7都显著提高了蛋白质输出。

4.2.8. 与circRNA的稳定性比较

1. RNA半衰期测量： 在HepG2和HCT116细胞中，通过RT-qPCR测量A7S线性mRNA与circRNA的RNA半衰期。
   • 结果：A7S线性mRNA的半衰期（HepG2中15.9h，HCT116中19.0h）与circRNA（HepG2中15.1h，HCT116中19.5h）相当，远高于对照线性mRNA。
2. 蛋白质水平比较： 测量荧光素酶蛋白质水平随时间的变化。
   • 结果：circRNA早期翻译效率低，总蛋白质输出（AUC）与对照线性mRNA相当。A7S线性mRNA在所有时间点均显示出更高的蛋白质生产，总蛋白质输出（AUC）比circRNA高5.3倍（HepG2）和5.8倍（HCT116）。
3. 免疫原性： 通过RT-qPCR测量ISG15和IFIT2水平，确认A7S线性mRNA和circRNA均未触发先天免疫反应。

4.2.9. 体内持续蛋白质表达

1. 动物模型： 对雄性$C57BL/6J$小鼠（8周龄）进行实验。
2. 递送： 通过尾静脉注射LNP封装的$m1Ψ$修饰荧光素酶mRNA（2 µg）。
3. 生物发光成像： 在第1, 3, 7, 10, 13天进行生物发光成像（bioluminescence imaging），追踪荧光素酶表达。在第14天处死小鼠，进行离体器官成像。

   • 结果：含有A7S的mRNA在第1天产生比对照线性mRNA高7倍、比circRNA高108倍的发光强度。到第3天，差异更显著（A7S比对照线性mRNA高380倍，比circRNA高688倍）。A7S线性mRNA的荧光素酶表达持续到第13天，甚至在第14天仍在肝脏中可检测到。

     该图像是多幅示意图，展示了不同RNA序列（Lin-Ctrl、CircRNA和Lin-A7S）在HepG2和HCT116细胞中相对RNA水平及其发光活性的变化，并通过成像显示其在小鼠体内的分布和强度。各组的亮度数据和图像也呈现于图i、图j与图k中。 Figure 6 展示了A7赋予线性mRNA类似circRNA的稳定性。

$a$图：线性mRNA（Lin-Ctrl和Lin-A7S）和circRNA格式的荧光素酶报告基因构建体示意图。 $b$图：HepG2细胞中荧光素酶RNA水平随时间的变化（电穿孔后12h, 18h, 24h, 30h），通过RT-qPCR测量。A7S线性mRNA的半衰期（15.9h）与circRNA（15.1h）相当。 $c$图：HCT116细胞中荧光素酶RNA水平随时间的变化（电穿孔后12h, 24h, 36h, 48h），通过RT-qPCR测量。A7S线性mRNA的半衰期（19.0h）与circRNA（19.5h）相当。 $d$图：HepG2细胞中$m1Ψ$修饰mRNA和circRNA在7天内的荧光素酶信号。A7S显著提高了蛋白质产量。 $e$图：HCT116细胞中$m1Ψ$修饰mRNA和circRNA在7天内的荧光素酶信号。 $f$图：HepG2和HCT116细胞中AUC值（从0天到7天）。A7S线性mRNA的总蛋白质输出比circRNA高5.3倍（HepG2）和5.8倍（HCT116）。 $g$图：小鼠实验示意图。小鼠接受mRNA静脉注射，随后进行生物发光成像。 $h$图：小鼠体内的生物发光成像。A7S在体内表现出持续的荧光素酶表达。 $i$图：小鼠实验中生物发光成像的平均辐射信号。A7S导致荧光素酶表达持续到第13天。 $j$图：第14天器官成像。 $k$图：第14天处死小鼠后肝脏生物发光成像的平均辐射信号。

5. 实验设置

5.1. 数据集

1. 病毒基因组序列： 2,678个感染脊椎动物的病毒基因组序列，来源于NCBI病毒基因组浏览器。这些序列用于构建RNA元件筛选文库。
2. 细胞系：
   • HEK293T/HEK293TR： 人胚肾细胞系，用于初级筛选（FACS富集）。
   • HCT116： 人结肠癌细胞系，用于次级筛选、诱变分析、Hire-PAT、DRS、RNA半衰期测量、免疫原性（immunogenicity）评估以及d2EGFP和HA蛋白表达分析。
   • HepG2： 人肝癌细胞系，用于跨细胞类型活性评估、RNA半衰期测量和荧光素酶表达动力学。
   • A549： 人肺腺癌细胞系，用于跨细胞类型活性评估。
   • MCF7： 人乳腺癌细胞系，用于跨细胞类型活性评估。
   • THP1： 人单核细胞白血病细胞系，用于跨细胞类型活性评估。
   • Jurkat： 人T淋巴细胞系，用于跨细胞类型活性评估。
   • HeLa： 人宫颈癌细胞系，用于ZCCHC2-KO实验和跨细胞类型活性评估。
   • ZCCHC14-KO细胞和ZCCHC2-KO细胞： 用于研究元件的TENT4辅助因子依赖性。
3. 动物模型： 雄性$C57BL/6J$小鼠（8周龄），来源于Daehan-Biolink。用于体内生物发光成像实验，评估mRNA在体内的表达持久性。

5.2. 评估指标

本研究使用了多种评估指标来衡量RNA元件的性能和作用机制，涵盖了mRNA稳定性、翻译效率、poly(A) tail动态、免疫反应和体内效果。

5.2.1. 荧光素酶活性 (Luciferase Activity)

1. 概念定义： 荧光素酶 (luciferase) 是一种生物发光酶，能够催化底物发出光。通过测量发光强度，可以间接量化细胞内荧光素酶蛋白的表达水平，从而评估mRNA的翻译效率和蛋白质产出。
2. 数学公式： 荧光素酶活性通常表示为相对发光单位（Relative Light Units, RLU），没有一个统一的数学公式。它通常是发光强度计读数。 $$\text{Luciferase Activity} = \text{RLU}_{\text{实验样本}} / \text{RLU}_{\text{对照样本}}$$
3. 符号解释：
   • $\text{RLU}_{\text{实验样本}}$：实验组样本的发光强度。
   • $\text{RLU}_{\text{对照样本}}$：对照组样本的发光强度。
   • 在本文中： 荧光素酶信号通常通过将荧光素酶 mRNA与海肾荧光素酶 (Renilla luciferase) mRNA共转染，用海肾荧光素酶的表达作为内部对照进行标准化，以校正转染效率差异。最终结果再与无$A$元件的对照mRNA进行标准化。

5.2.2. 流式细胞术 (Flow Cytometry)

1. 概念定义： 流式细胞术 (Flow Cytometry) 是一种细胞分析技术，通过测量细胞通过激光束时散射光和荧光，来量化细胞群体的特征，如d2EGFP（destabilized EGFP，不稳定的EGFP）表达水平。
2. 数学公式： 流式细胞术结果通常以平均荧光强度（Mean Fluorescence Intensity, MFI）或特定荧光阳性细胞的百分比来表示，没有统一的数学公式。 $$\text{GFP 信号} = \text{MFI}_{\text{d2EGFP 阳性细胞}}$$
3. 符号解释：
   • $\text{MFI}_{\text{d2EGFP 阳性细胞}}$：d2EGFP阳性细胞群体的平均荧光强度。
   • 在本文中： 用于追踪d2EGFP $m1Ψ$修饰mRNA在HCT116细胞中的表达持续时间。

5.2.3. RNA水平测量 (RNA Level Measurement)

1. 概念定义： 通过RT-qPCR（逆转录定量PCR）技术，量化特定mRNA在细胞内的丰度。这用于评估mRNA的稳定性和半衰期，以及免疫反应相关基因（如ISG15和IFIT2）的表达。
2. 数学公式： RT-qPCR结果通常用$ΔCt$或$ΔΔCt$方法进行相对定量。
   • 相对表达量公式 (2^-(ΔΔCt) 方法): $$\text{相对表达量} = 2^{-\Delta\Delta C_t}$$ 其中，$\Delta C_t = C_{t, \text{目标基因}} - C_{t, \text{内参基因}}$，并且 $\Delta\Delta C_t = \Delta C_{t, \text{实验组}} - \Delta C_{t, \text{对照组}}$。
3. 符号解释：
   • $C_{t, \text{目标基因}}$：目标基因的Ct值（扩增曲线达到阈值时的循环数）。
   • $C_{t, \text{内参基因}}$：GAPDH等内参基因的Ct值。
   • $\Delta C_{t, \text{实验组}}$：实验组的$ΔCt$值。
   • $\Delta C_{t, \text{对照组}}$：对照组的$ΔCt$值。
   • 在本文中： RNA半衰期通过拟合指数衰减模型（exponential decay model）并根据细胞倍增时间进行调整来计算。ISG15和IFIT2水平用于评估mRNA的免疫原性。

5.2.4. 蛋白质水平测量 (Protein Level Measurement)

1. 概念定义： Western blot（蛋白质印迹）是一种常用的分子生物学技术，用于检测和量化生物样品中特定蛋白质的表达水平。
2. 数学公式： Western blot信号强度通过图像分析软件量化，通常表示为相对于内参蛋白（如GAPDH）的相对密度单位或相对灰度值。 $$\text{相对蛋白质水平} = \frac{\text{目标蛋白信号强度}}{\text{内参蛋白信号强度}}$$
3. 符号解释：
   • $\text{目标蛋白信号强度}$：HA蛋白条带的信号强度。
   • $\text{内参蛋白信号强度}$：GAPDH蛋白条带的信号强度。
   • 在本文中： 用于量化HA蛋白的表达水平，评估A7元件在不同CDS和密码子优化背景下的增强效果。

5.2.5. Poly(A) Tail 长度分析 (Poly(A) Tail Length Analysis)

1. 概念定义： Poly(A) tail长度对mRNA的稳定性和翻译至关重要。Hire-PAT和Nanopore DRS是两种用于精确测量poly(A) tail长度及核苷酸组成的先进技术。
   • Hire-PAT (High-resolution poly(A) tail assay): 通过将poly(A) tail转化为含有GI（鸟苷-肌苷）的异源聚合物，然后通过RT-PCR和片段分析来测量其长度。
   • Nanopore DRS (Nanopore Direct RNA Sequencing): 直接测序RNA分子，避免PCR偏差，通过分析离子电流信号来直接确定poly(A) tail的长度和其中的非腺苷酸掺入（混合尾）。
2. 数学公式： 无统一公式，结果通常以poly(A) tail长度分布的直方图或中位数长度来表示。 $$\text{Poly(A) 尾长度} = \text{碱基数}$$
3. 符号解释：
   • 碱基数：poly(A) tail中的核苷酸数量。
   • 在本文中： DRS中通过dorado软件进行初始估计，并使用定制方法基于离子电流信号精炼poly(A) tail的5'和3'末端位置，并通过转座速度（translocation speed）将信号空间缩放到碱基数。

5.2.6. 生物发光成像 (Bioluminescence Imaging)

1. 概念定义： 生物发光成像 (Bioluminescence Imaging) 是一种非侵入性的体内成像技术，通过检测报告基因（如荧光素酶）产生的生物发光信号来追踪基因表达或细胞活动。
2. 数学公式： 发光信号通常以辐射度（radiance）表示，单位为$p/s/cm²/sr$（光子/秒/平方厘米/球面度）。 $$\text{发光信号} = \text{辐射度}_{\text{实验组}} - \text{辐射度}_{\text{对照组}}$$ 折叠倍数变化 (Fold Change) 的计算： $$\text{Fold Change} = \frac{\text{辐射度}_{\text{实验组}} - \text{辐射度}_{\text{PBS 对照组}}}{\text{辐射度}_{\text{参照组}} - \text{辐射度}_{\text{PBS 对照组}}}$$
3. 符号解释：
   • $\text{辐射度}_{\text{实验组}}$：实验组的生物发光信号强度。
   • $\text{辐射度}_{\text{对照组}}$：对照组的生物发光信号强度（例如PBS组）。
   • $\text{辐射度}_{\text{参照组}}$：用于计算倍数变化的参照组信号强度（例如对照线性mRNA组）。
   • 在本文中： 用于评估mRNA在小鼠体内荧光素酶表达的水平和持续时间。

5.2.7. 统计显著性 (Statistical Significance)

1. 概念定义： 统计显著性用于判断实验观察到的差异是否可能由偶然因素引起，而不是真实的效应。
2. 数学公式： 主要通过$P$值 (P-value) 来表示。
   • $P < 0.05$：通常被认为是具有统计学意义。
   • $P < 0.01$：通常被认为是具有高度统计学意义。
3. 符号解释：
   • $P$：$P$值。
   • 在本文中： 广泛使用双侧学生t检验 (two-sided Student's t-test)、Wald检验 (Wald test)（用于log2倍数变化和调整$P$值）和双侧Mann-Whitney U检验 (two-sided Mann-Whitney U-test)（用于体内实验）。

5.2.8. 曲线下面积 (Area Under the Curve, AUC)

1. 概念定义： AUC是在曲线图（通常是蛋白质表达水平对时间）下方的面积，用于量化一段时间内总的蛋白质产出或药物暴露量。
2. 数学公式： AUC通常通过数值积分方法（如梯形法则，trapezoidal rule）来计算。 $$\text{AUC} = \sum_{i=1}^{N-1} \frac{(y_i + y_{i+1})}{2} (x_{i+1} - x_i)$$
3. 符号解释：
   • $N$：数据点数量。
   • $y_i$：在时间点 $x_i$ 对应的蛋白质表达水平。
   • 在本文中： 用于比较不同mRNA形式（线性mRNA与circRNA）在一定时间范围内的总荧光素酶蛋白质产出。

5.2.9. Spearman相关系数 (Spearman Correlation Coefficient)

1. 概念定义： Spearman相关系数 (Spearman Correlation Coefficient) 是一种非参数的统计量，用于衡量两个变量之间秩关系（monotonic relationship）的强度和方向。
2. 数学公式： $$\rho = 1 - \frac{6 \sum d_i^2}{n(n^2 - 1)}$$
3. 符号解释：
   • $\rho$：Spearman相关系数。
   • $d_i$：两个变量中第 $i$ 个数据点的秩次（rank）差。
   • $n$：数据点的数量。
   • 在本文中： 用于评估次级筛选结果的重复性（reproducibility），在不同重复实验的UMI计数之间计算。

5.3. 对比基线

本研究将自己发现的RNA元件与以下基线模型和对照进行了比较：

1. Control UTR (对照UTR): 包含质粒来源区域和miR-1结合位点的UTR序列，作为通用对照。
2. mRNA-1273 UTR： 来源于COVID-19疫苗mRNA-1273（Moderna疫苗）的3'UTR，该UTR来源于人α-珠蛋白（HBA）基因。
3. BNT162b2 UTR： 来源于COVID-19疫苗BNT162b2（辉瑞/BioNTech疫苗）的3'UTR，是人AES UTR和mtRNR基因的融合体。
4. Previously identified viral elements (K1-K9)： 作者团队先前筛选到的病毒元件，用于评估它们在$m1Ψ$修饰mRNA背景下的活性，结果显示大多数丧失活性。K3和K4作为部分活性对照。
5. Circular RNA (circRNA, 环状RNA)： 一种已知具有高稳定性的替代RNA形式。本研究使用优化过的circRNA，包含HRV-B3 IRES和HBA 3'UTR。用于比较A7线性mRNA的稳定性和翻译效率。
6. Unmodified mRNAs (未修饰mRNA)： 未经过碱基修饰的mRNA，用于比较$m1Ψ$修饰mRNA的优越性。
7. Inactive mutants (非活性突变体)： 如K4m和K5m，用于作为筛选中的阴性对照，确保筛选的特异性。
8. PBS (Phosphate-buffered saline)： 在体内实验中作为注射对照。

6. 实验结果与分析

本节详细阐述了论文的实验结果，并对核心发现进行了深入分析。

6.1. 核心结果分析

6.1.1. 已知UTR元件与m1Ψ修饰的兼容性有限

研究首先证实了$m1Ψ$修饰mRNA相比未修饰mRNA具有优越的性能（图1a），这与之前报道一致，尤其在脂质纳米颗粒 (LNP) 递送时效果更显著，可能是由于避免了TRIM25介导的抑制。然而，当测试商业COVID-19疫苗中使用的3'UTR（如mRNA-1273和BNT162b2的3'UTR）时，它们在$m1Ψ$修饰mRNA中的表现并不理想，甚至不如对照UTR或仅略微提高表达（图1b）。更重要的是，作者团队先前发现的病毒元件（K1-K9）中，大多数在$m1Ψ$修饰mRNA背景下丧失了活性，仅有K3和K4保留了部分功能（图1c）。这突出表明，需要识别能够与碱基修饰兼容的新型RNA稳定性增强剂。

6.1.2. 系统性筛选发现m1Ψ兼容的病毒RNA元件

通过对196,277个病毒序列进行两阶段大规模筛选，研究成功识别出11个显著增强$m1Ψ$修饰mRNA稳定性和翻译的元件（A1-A11）。初级筛选（基于FACS富集GFP高表达细胞）初步筛选出约10,784个候选序列。次级筛选（基于$m1Ψ$修饰IVT mRNA转染和RNA测序分析$36h/0h$的log2倍数变化）进一步鉴定了131个显著增强mRNA稳定性的tile（调整$P$值 < 0.001，log2倍数变化 > 0.4），这些tile聚类形成11个稳定元件（图1e,f）。验证实验显示，在$m1Ψ$修饰mRNA中，A1, A2, A4, A6, A7五个元件保留了超过60%的活性，证明了它们的$m1Ψ$兼容性。其中，许多短片段形式（A1S, A4S, A5S, A6S, A7S, A9S, A10S, A11S）甚至表现出与完整197 nt序列相当或更高的活性，表明它们包含了核心功能基序（图1g,h）。

该图像是插图，展示了不同RNA元素在mRNA稳定性影响下的荧光素酶活性及筛选过程。在g和h图中，m1ψ 相较于对照显示了增强的稳定性，且通过数据分析和筛选确定了候选RNA元素。 Figure 1 展示了系统性筛选病毒元件以增强$m1Ψ$修饰mRNA的过程。

$a$图：未修饰（$U$）和修饰（$m1Ψ$和m5C）IVT mRNA在5天内的荧光素酶信号。$m1Ψ$显示出优越性能。 $b$图：3'UTR报告基因IVT mRNA的荧光素酶信号。mRNA-1273和BNT162b2的3'UTR表现不佳。 $c$图：转染3天后未修饰或$m1Ψ$修饰荧光素酶mRNA的荧光素酶活性。已知$K$元件在$m1Ψ$修饰mRNA中大多失活。 $d$图：病毒序列被平铺到EGFP基因的3'UTR，并整合到HEK293TR细胞中进行初级筛选（FACS分选高GFP荧光细胞）。富集的oligos``PCR扩增并克隆到luciferase CDS的3'UTR中进行次级筛选。 $e$图：次级筛选数据，$y$轴为$36h/0h$ RNA水平的log2比值，$x$轴为0h UMI计数log2值。橙色标记的稳定tile来自11种病毒。 $f$图：按排名排序的单个元件的log2倍数变化（$36h/0h$）。橙色标记稳定元件，黑色线突出显示选定的验证候选元件。 $g$图：在HCT116细胞中验证22个选定tile（A1-A11及其短片段），包括未修饰和$m1Ψ$修饰mRNA。 $h$图：在HCT116细胞中验证22个选定tile（A1-A11及其短片段），包括未修饰和$m1Ψ$修饰mRNA。短片段形式的活性。

6.1.3. 结构特征与TENT4依赖机制

这11个元件来源于不同的病毒家族（图2a），但10个元件（除A7外）都共享一个CNGG基序的环状结构（图2b）。A7是唯一的例外，它不含CNGG基序，而是形成两个由内部环（internal loop）分隔的茎环（stem loops），暗示其作用机制可能不同。

深层诱变分析揭示了这些元件的关键结构和序列特征（图3）。例如，A7采用分支结构，其中内部环（IL）包含AGACCY基序，茎环2（SL2）包含GGGGNARUD基序，这两个基序对A7的稳定功能至关重要。其他元件的CNGGN五联环中，C, G, G（1, 3, 4位）核苷酸是关键。

该图像是示意图，展示了多种病毒的基因组特征，包括HCMV、HBV、Turkey calicivirus等。这些序列的长度和结构特征对于理解RNA稳定性增强剂的筛选过程至关重要。 Figure 2 展示了RNA稳定性增强元件的基因组位置和预测的RNA结构。

$a$图：$m1Ψ$修饰mRNA中增强基因表达的病毒元件的基因组组织和位置。 $b$图：预测的RNA结构。除A3外，所有其他元件的RNA结构均使用EternaFold预测。

机制研究证实，所有11个元件的增强作用都被TENT4抑制剂RG7834抑制，表明它们都依赖于TENT4（图4a,b）。Hire-PAT和纳米孔DRS进一步显示，这些病毒元件能促使poly(A) tail延长，甚至超过原始长度，并且掺入非腺苷酸形成混合尾，这种效应也完全依赖于TENT4（图4c,d）。 辅助因子分析发现，所有含有CNGG环的元件（$A1-A6, A8-A11$）都严格依赖ZCCHC14，在ZCCHC14-KO细胞中失活。而A7在ZCCHC14-KO和ZCCHC2-KO细胞中都保持活性，表明它可能通过一种未识别的适配蛋白招募TENT4（图4a,e,g,h）。这使得A7成为RNA稳定性增强剂中一个独特类别。

6.1.4. A7的广谱活性和分子环境适应性

A7及其短片段A7S在多种细胞类型（HepG2, A549, MCF7, Jurkat, HeLa）中表现出最强和最广泛的增强活性，仅在THP1细胞中活性较低，表明其具有跨谱系的通用性（图5a）。A7S还与m5C修饰兼容，这进一步拓宽了其应用范围（图5b）。 与商业疫苗UTR相比，A7S显著提高了蛋白质产量，在转染后第3天和第5天分别带来65倍和114倍的蛋白质增加，AUC值也高出4-6倍（图5c）。 此外，A7的活性不受5'UTR（如mRNA-1273的5'UTR）、编码序列长度（使用d2EGFP）、密码子优化策略（多种HA基因的密码子优化）、RNA二级结构、尿苷含量或翻译位置（游离或ER相关核糖体）的影响（图5d,e,f,g,h）。这种卓越的稳健性使得A7成为一个高度通用的IVT mRNA性能增强工具。

该图像是多幅图表，展示了不同 RNA 元素对荧光素酶活性的影响及其 mRNA 稳定性。图 a 和 e 详细说明了在 96 小时内的荧光素酶活性，图 c 和 g 则比较了各种 RNA 处理条件下的信号强度。图 d 展示了不同 RNA 元素的尾部长度分布，图 h 说明了含有 CNGG 动机的元件与 mRNA 稳定性之间的关系。 Figure 5 展示了A7元件在不同分子背景下的功能。

$a$图：在HepG2, A549, MCF7, THP1, Jurkat, HeLa细胞中，代表性$A$元件（$m1Ψ$修饰mRNA）的荧光素酶表达。A2和A7S在多细胞系中表现出强大的活性。 $b$图：转染4天后m5C修饰荧光素酶mRNA的荧光素酶活性。仅A7S在m5C修饰下仍功能。 $c$图：转染后1, 3, 5天3'UTR报告基因的荧光素酶信号。A7S显示出比mRNA-1273和BNT162b2更强的蛋白质生产。 $d$图：含有A7S元件的d2EGFP mRNA报告基因构建体示意图。 $e$图：HCT116细胞中$m1Ψ$修饰d2EGFP mRNA（含HBA UTR和A7S元件）的d2EGFP表达（第1天至第5天），通过流式细胞术测量。A7S显著延长了GFP信号的持续时间。 $f$图：含有A7元件的HA报告基因IVT mRNA构建体示意图。 $g$图：使用Western blot分析各种密码子优化CDS的HA蛋白表达量。A7在所有CDS中均显著提高HA蛋白表达。 $h$图：使用Western blot分析HA蛋白表达量。

6.1.5. A7使线性mRNA与circRNA具有可比稳定性但翻译效率更高

RNA半衰期测量显示，A7S线性mRNA的半衰期（在HepG2细胞中为15.9h，HCT116细胞中为19.0h）与circRNA的半衰期（在HepG2细胞中为15.1h，HCT116细胞中为19.5h）相当，且远高于对照线性mRNA（图6b,c）。 在蛋白质水平上，尽管circRNA具有更长的半衰期，但其早期翻译效率较低，导致总蛋白质输出（AUC）与快速衰减的对照线性mRNA相当。相比之下，A7S线性mRNA在所有时间点都显示出显著更高的蛋白质生产，其总蛋白质输出AUC比circRNA高出5.3倍（HepG2）和5.8倍（HCT116）（图6d,e,f）。这表明A7不仅赋予线性mRNA``circRNA级别的稳定性，而且显著提高了翻译效率。此外，A7S线性mRNA和circRNA均未触发ISG15和IFIT2等免疫反应基因的表达（Extended Data Fig. 7b），证实了它们的低免疫原性。

6.1.6. A7实现体内持续蛋白质表达

在小鼠体内实验中，含有A7S的mRNA在第1天就产生了比对照线性mRNA高~7倍、比circRNA高108倍的生物发光强度。到第3天，这种差异更加显著（380倍于对照线性mRNA，688倍于circRNA）。尽管circRNA的信号衰减速度慢于对照线性mRNA，但其强度始终低于A7S线性mRNA。最重要的是，含有A7S的RNA在体内维持荧光素酶表达长达13天，甚至在第14天处死小鼠后，肝脏中仍能检测到荧光素酶信号（图6h,i,j,k）。这强有力地证明了A7显著增强了线性mRNA在体内的表达持久性。

6.2. 数据呈现 (表格)

本论文未提供需转录的Markdown或HTML格式表格，所有数据均以图表形式呈现。

6.3. 消融实验/参数分析

1. 深层诱变分析 (Deep Mutagenesis Analysis)：

   • 通过对A1S, A2, A4, A6, A7进行单核苷酸替换、删除、补偿性突变、插入和双替换等4,542种突变，揭示了元件内部的关键结构和序列特征（图3）。
   • 例如，A7的内部环（IL）中的AGACCY基序和茎环2（SL2）中的GGGGNARUD基序被确定为其稳定功能的关键。
   • 其他CNGGN五联环元件中，C, G, G（1, 3, 4位）核苷酸是功能核心。
   • 环的大小也影响元件功能，5nt环比4nt或6nt环更活跃。
   • 这些分析不仅帮助精确预测了RNA二级结构（例如A7的实际结构与EternaFold预测不同），也提供了优化元件的依据。

2. TENT4抑制剂和辅助因子敲除实验：

   • TENT4抑制： 使用RG7834（TENT4抑制剂）处理细胞，发现所有11个元件的增强作用均被消除（图4a,b），证实了它们对TENT4的依赖性。这是一种功能性的消融实验，去除了TENT4的功能，观察到元件活性的消失。
   • ZCCHC14/ZCCHC2敲除： 在ZCCHC14-KO和ZCCHC2-KO细胞系中测试元件活性。

     • 结果显示，所有含有CNGG基序的元件（$A1-A6, A8-A11$）在ZCCHC14-KO细胞中失活，但在ZCCHC2-KO细胞中功能正常（图4a,e），表明它们严格依赖ZCCHC14。这有效地“消除了”ZCCHC14的作用，揭示了元件的辅助因子特异性。

     • A7在两种KO细胞系中都保持活性（图4a,e），表明它不依赖已知的TENT4辅助因子ZCCHC14或ZCCHC2，暗示存在未识别的适配蛋白。这进一步对A7的独特机制进行了“消融”式分析。

       这些实验共同构成了对元件功能组分、关键结构域及其作用机制的深入分析，验证了模型（元件）中各组件（如CNGG基序、IL和SL2区域）的有效性和重要性。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究通过对196,277个病毒序列进行大规模、系统性筛选，成功识别出11个能够显著增强$m1Ψ$修饰mRNA稳定性和翻译效率的RNA元件。这些元件通过招募TENT4酶，促进poly(A) tail的延长和混合加尾，从而有效阻止去腺苷酸化。其中，A7元件表现出卓越的性能，其作用机制不依赖于已知的TENT4辅助因子ZCCHC14和ZCCHC2。A7在多种细胞类型、不同碱基修饰（包括$m1Ψ$和m5C）、以及多样化的分子背景（5'UTR、CDS、密码子优化等）下均保持稳健活性。在体外实验中，含有A7的线性mRNA达到了与circRNA相当的稳定性，同时翻译效率显著更高。更重要的是，在小鼠体内，A7能够使线性mRNA实现持续超过2周的蛋白质表达。这些发现为开发高效、持久、低免疫原性且易于制造的线性mRNA治疗平台提供了简单而强大的解决方案。

7.2. 局限性与未来工作

1. TENT4偏倚性： 尽管所有11个元件都依赖TENT4，但作者承认其筛选方案可能对TENT4介导的调控机制存在偏倚。这不排除存在其他非TENT4依赖的RNA稳定性增强机制未被发现的可能性。
2. A7辅助因子的未识别： A7的独特之处在于不依赖ZCCHC14或ZCCHC2，这表明其可能招募了尚未识别的TENT4适配蛋白。未来工作需要深入研究并鉴定这个未知的辅助因子，这将有助于全面理解A7的作用机制，并可能发现新的RNA调控通路。
3. 体内进一步表征： 尽管A7在小鼠模型中表现出卓越的体内持久性，但仍需要进一步的体内表征，包括不同给药途径、剂量响应、长期安全性、药代动力学和药效学研究，以支持其未来的临床转化应用。
4. 作用机制的精细化： 深层诱变分析虽然揭示了关键结构和序列特征，但对于这些特征如何精确地招募TENT4或其辅助因子，以及如何在分子水平上调控混合加尾，仍需更精细的结构生物学和生化研究。
5. 跨物种和疾病模型的验证： A7在小鼠肝脏中表现良好，但在其他器官、不同动物模型或人类疾病模型中的表现仍需验证。

7.3. 个人启发与批判

7.3.1. 个人启发

1. 病毒作为生物学工具的宝库： 这项研究再次强调了病毒作为生物学工具的巨大潜力。病毒为了在宿主细胞中生存和复制，演化出了极其精妙的机制来劫持或操纵宿主细胞通路。系统性地挖掘病毒基因组，可以发现意想不到的调控元件，为生物技术和医学应用提供灵感。
2. 克服技术瓶颈的策略： mRNA疗法面临的核心瓶颈是稳定性、翻译效率和免疫原性。本研究通过“兼容碱基修饰”这一核心设计理念，直接解决了现有解决方案的痛点，展示了在技术发展中聚焦核心限制因素的重要性。
3. A7的巨大应用潜力： A7元件的通用性（跨细胞类型、修饰兼容、分子环境适应性）和强大效果（高稳定性、高翻译效率、体内持久性）使其成为mRNA疗法领域的“游戏规则改变者”。它有望显著简化mRNA的开发和制造，降低成本，并拓宽mRNA的应用范围，特别是对于需要长期蛋白质表达的基因替代疗法、免疫疗法和组织重编程。
4. 机制研究的重要性： 仅仅发现功能性元件是不够的，深入理解其作用机制（TENT4依赖的混合加尾）为进一步优化和设计新的RNA元件奠定了基础。A7的独特机制暗示了RNA调控的复杂性和更多未知领域的存在。
5. 线性mRNA的复兴： 过去，circRNA因其稳定性被寄予厚望，但翻译效率低是其硬伤。A7的发现有望“复兴”线性mRNA，使其在性能上超越甚至替代部分circRNA应用，同时保持线性mRNA制造的简便性优势。

7.3.2. 批判

1. 筛选范围的泛化性： 尽管筛选了196,277个病毒序列，这已经非常庞大，但这些病毒主要感染脊椎动物。是否存在其他生物界（如植物病毒、昆虫病毒）中更强大或机制更独特的RNA稳定性元件？这项研究的发现是否能完全代表所有可能存在的天然增强剂？
2. TENT4机制的独占性： 所有的11个阳性元件都依赖TENT4，这可能反映了TENT4在脊椎动物细胞mRNA后转录调控中的主导作用。然而，这也可能是筛选条件（例如，选择HCT116细胞、$m1Ψ$修饰mRNA）导致的偏向性。未来可以探索在不同细胞类型或生理条件下，是否存在其他不依赖TENT4的RNA稳定机制。
3. A7机制的黑箱： A7不依赖ZCCHC14或ZCCHC2，但仍依赖TENT4，这意味着存在一个未知的TENT4适配蛋白。这个“黑箱”是当前研究的一个重要局限。在不完全了解其精确分子机制的情况下，对A7进行进一步的合理设计和优化可能会受限。
4. 体内免疫原性与安全性： 论文提到了A7线性mRNA未触发ISG15和IFIT2表达，但在复杂的体内环境中，尤其是在长期或重复给药的情况下，是否会引发其他形式的免疫反应或潜在的毒性（例如，TENT4作为宿主蛋白，持续的poly(A) tail延长是否会影响内源性mRNA平衡）仍需详尽评估。
5. A7的紧凑性与最小化： 论文发现短片段A7S与长片段A7活性相当，但A7S仍有155 nt。是否能进一步将A7的核心功能基序最小化，以提高mRNA的转录效率和降低潜在的免疫原性（通常越短的RNA元件越不容易被识别）？更短的元件也有助于在空间有限的治疗性mRNA中进行整合。