1. 论文基本信息

1.1. 标题

腺嘌呤碱基编辑器工程化减少旁观者胞嘧啶编辑 (Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines)

1.2. 作者

You Kyeong Jeong, SeokHoon Lee, Gue-Ho Hwang, Sung-Ah Hong, Se-eun Park, Jin-Soo Kim, Jae-Sung Woo, Sangsu Bae

1.3. 发表期刊/会议

Nature Biotechnology

1.4. 发表年份

2021

1.5. 摘要

腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine Base Editors, ABEs) 能够在基因组的特定位点实现 A 到 G 的精确转换。然而，ABEs 也可能在目标位点诱导胞嘧啶 (cytosine) 脱氨基反应。为了减少这种胞嘧啶编辑活性，研究人员对常用的腺苷脱氨酶 TadA7.10 进行了工程改造。结果发现，在 TadA7.10 中引入 D108Q 突变的 ABE7.10，其胞嘧啶脱氨基活性降低了十倍。D108Q 突变还能减少两种最新开发的高活性 ABE 版本（ABE8e 和 ABE8s）中的胞嘧啶脱氨基活性，并且与降低脱靶编辑的 V106W 突变兼容。此外，含有 P48R 突变的 ABE7.10 显示出增加的胞嘧啶脱氨基活性和显著降低的腺嘌呤编辑率，从而产生了一种用于 TC 到 TT 或 TC 到 TG 转换的 TC 特异性碱基编辑工具，拓宽了碱基编辑器的应用范围。

1.6. 原文链接

/files/papers/692ee99d51a773d4bd3509f8/paper.pdf (已正式发表)

2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

核心问题： 腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine Base Editors, ABEs) 在实现 A-to-G 转换时，存在脱靶效应和旁观者编辑 (bystander editing) 问题，特别是对胞嘧啶 (cytosine) 的非特异性编辑。

重要性： ABEs 是一种无需 DNA 双链断裂 (DSB) 即可实现 A/T 到 G/C 转换的有效基因编辑工具，在基因治疗和基础研究中具有巨大潜力。然而，现有的 ABEs 存在一些“副作用”：

1. sgRNA 依赖的脱靶 DNA 编辑： 由 Cas 核酸酶的不完美靶向特异性引起。

2. sgRNA 非依赖的转录组范围脱靶 RNA 编辑： 由腺苷脱氨酶的 DNA 和 RNA 结合特性引起。

3. ABEs 介导的目标位点胞嘧啶脱氨基： 本文主要关注的问题，即在靶向腺嘌呤时，也可能意外地编辑附近的胞嘧啶。

   挑战或空白： 尽管前人已经对 ABEs 进行了工程改造以减少 RNA 脱靶编辑，但 ABE 介导的胞嘧啶催化效应尚未得到认真解决。由于腺嘌呤脱氨酶 (eTadA) 的催化位点对腺嘌呤和胞嘧啶都是通用的，因此如何在不降低腺嘌呤转换活性的前提下，减少胞嘧啶转换活性是一个重要挑战。

创新思路： 作者提出通过对腺嘌呤脱氨酶 TadA7.10 的活性位点及其周围区域进行额外的突变，以期实现对腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的区分，从而消除或增强胞嘧啶催化活性。

2.2. 核心贡献/主要发现

1. D108Q 突变减少旁观者胞嘧啶编辑和 RNA 脱靶编辑： 发现 TadA7.10 中的 D108Q 突变能显著降低 ABEs（包括 ABE7.10、ABE8e 和 ABE8s）的胞嘧啶脱氨基活性约十倍，同时兼容 V106W 突变（已知的减少脱靶编辑的突变）。此外，D108Q 突变也显著降低了 RNA 脱靶编辑活性，使得 ABE8eWQ (ABE8e 包含 V106W 和 D108Q) 成为一个优化版本。
2. P48R 突变生成 TC 特异性碱基编辑器： 发现 TadA7.10 中的 P48R 突变显著增加了胞嘧啶编辑活性，同时大幅降低了腺嘌呤编辑活性。通过与尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (uracil DNA glycosylase inhibitor, UGI) 融合，ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 被开发为 TC 特异性的碱基编辑器，分别用于 TC-to-TG 和 TC-to-TT 转换，且旁观者编辑效应可忽略不计。
3. 拓宽碱基编辑器的应用范围： 这些工程化的 ABE 变体，特别是 TC 特异性工具，可以用于精确纠正与人类疾病相关的致病性突变，例如 TUBB6 和 PTPN11 基因中的错义突变，显示了其在基因治疗中的巨大潜力。

3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

• 碱基编辑器 (Base Editor, BE)： 一种基因编辑工具，能够通过化学修饰将一个碱基对（例如 A/T）精确地转换为另一个碱基对（例如 G/C），而无需在 DNA 中引入双链断裂 (Double-Strand Break, DSB)。这避免了 DSB 诱导的随机插入/缺失突变或大的基因组重排，提高了编辑的精确性和安全性。

• 腺嘌呤碱基编辑器 (Adenine Base Editor, ABE)： 特定类型的基础编辑器，主要用于将 A/T 碱基对转换为 G/C 碱基对。其核心组分包括：

  • Cas 核酸酶 (Cas nuclease) 或切口酶 (nickase, nCas)： 通常是失活的 Cas9 (dCas9) 或 Cas9 切口酶 (nCas9, 如 Cas9-D10A)，负责将编辑器定位到基因组的特定 DNA 序列。nCas9 仅在一条 DNA 链上产生切口，而不是双链断裂。
  • 腺苷脱氨酶 (Adenosine Deaminase)： 负责将腺嘌呤 (A) 脱氨基为肌苷 (I)，而肌苷在 DNA 复制或修复过程中会被识别为鸟嘌呤 (G)。本文主要关注的是经工程改造的 TadA (eTadA)。
  • 尿嘧啶 DNA 糖基化酶抑制剂 (Uracil DNA Glycosylase Inhibitor, UGI)： 有时会融合到 ABE 中，用于抑制细胞内尿嘧啶 DNA 糖基化酶的活性。在某些情况下，胞嘧啶脱氨基会产生尿嘧啶 (U)，UGI 可以防止 U 被切除，从而促进 C-to-T 转换。

• TadA (tRNA-specific adenosine deaminase from Escherichia coli)： 大肠杆菌中的一种 tRNA 特异性腺苷脱氨酶。野生型 TadA (wtTadA) 主要作用于 RNA，但在 ABEs 中，通过定向进化 (directed evolution) 得到的工程化 TadA (eTadA, 如 TadA7.10、TadA8e、TadA8s) 能够特异性地作用于 DNA。

• 旁观者编辑 (Bystander Editing)： 指碱基编辑器在目标碱基附近，对非目标碱基（如本研究中的胞嘧啶）进行的非预期编辑。这会降低编辑的特异性和安全性。

• 脱靶效应 (Off-target Effects)： 指碱基编辑器在基因组中非预期的位点进行编辑。这包括：

  • DNA 脱靶编辑： 编辑器在与 sgRNA 部分匹配的非目标 DNA 序列上进行编辑。
  • RNA 脱靶编辑： 腺苷脱氨酶非特异性地编辑细胞内的 RNA 分子。

3.2. 前人工作

• ABEs 的开发： 初始实用的 ABE 版本 ABE7.10 由 Cas9 切口酶 (nCas9)、野生型 TadA (wtTadA) 和工程化 TadA (eTadA, TadA7.10) 融合而成。TadA7.10 是通过定向进化使其在 DNA 上发挥作用，而非 RNA。
• 减少 RNA 脱靶效应的 ABE 版本：
  • F148A 突变： Yang 课题组发现，在 wtTadA 和 TadA7.10 中引入 F148A 突变可以降低 RNA 的滥用脱氨活性。
  • wtTadA 缺失或失活： Liu 和 Joung 课题组独立发现 wtTadA 是 RNA 脱氨活性的主要原因，而其缺失不影响 DNA 编辑活性。
    • Liu 课题组通过 E59A 突变使 wtTadA 失活，并发现 TadA7.10 中的 V106W 突变能在不降低 DNA 脱靶活性的情况下减少 RNA 脱靶效应。
    • Joung 课题组完全移除了 wtTadA，并向 TadA7.10 添加了 K20A/R21A 或 V82G 突变，以降低 RNA 脱靶效应。
• 增加编辑活性的 ABE 版本： Richter 等人开发了 ABE8e，Gaudelli 等人开发了 ABE8s (AI3E8.17-m)，这些版本都显示出增强的脱氨动力学或编辑活性。
• ABE 介导的胞嘧啶脱氨基： 先前研究已表明，ABE7.10 及其前身（ABE6.3、ABE7.8、ABE7.9）以及优化版本 ABEmax 都能在特定基序 (TC*N) 的狭窄编辑窗口内催化胞嘧啶脱氨基。

3.3. 技术演进

ABEs 的发展历程是从最初的功能验证，到逐步优化其活性和特异性。早期的工作主要集中在实现 A-to-G 转换的功能，随后发现了 RNA 脱靶和旁观者胞嘧啶编辑等问题。研究人员通过定向进化和理性设计，引入了多种突变来解决这些问题：

1. 提高 DNA 靶向性： 对 Cas9 进行改造，提高其对 sgRNA 靶序列的特异性。
2. 降低 RNA 脱靶： 主要通过失活或移除 wtTadA，以及在 eTadA 中引入如 F148A、V106W、K20A/R21A、V82G 等突变。
3. 增强编辑活性： 开发了 ABE8e 和 ABE8s 等高活性版本。
4. 解决旁观者胞嘧啶编辑 (本文焦点)： 本文通过理性设计和测试 eTadA 变体，发现了关键突变 D108Q 和 P48R，分别用于减少和增强胞嘧啶催化活性，从而实现了 ABE 的进一步优化和功能拓展。

3.4. 差异化分析

本文的工作与先前研究的主要区别在于：

• 聚焦胞嘧啶旁观者编辑： 尽管之前的研究关注了 RNA 脱靶效应，但 ABE 介导的胞嘧啶旁观者编辑问题尚未得到系统性解决。本文首次深入探讨了 eTadA 中影响胞嘧啶编辑活性的关键突变。
• 理性设计策略： 作者结合 TadA 直系同源物序列比对和结构信息，对活性位点周围的氨基酸进行了理性设计，而非完全依赖随机突变库筛选。这种方法更具指导性和效率。
• 双向工程： 不仅找到了减少胞嘧啶编辑的突变 (D108Q)，还找到了增强胞嘧啶编辑的突变 (P48R)，后者使得开发出 TC 特异性碱基编辑器成为可能。这不仅解决了 ABE 的一个缺点，还拓展了其功能，使其能够实现 C-to-G 或 C-to-T 的特定转换，填补了现有碱基编辑工具的空白。
• 兼容性验证： 新发现的 D108Q 突变与已知的降低脱靶编辑的 V106W 突变兼容，并在高活性 ABE 版本（ABE8e 和 ABE8s）中也表现出效果，显示了其广泛的适用性。

4. 方法论

4.1. 方法原理

本文的核心方法原理在于通过对腺苷脱氨酶 TadA7.10 的氨基酸序列进行理性设计和突变筛选，以调控其对腺嘌呤和胞嘧啶的脱氨基活性。研究人员利用 TadA 直系同源物 (orthologs) 的序列比对信息和 Staphylococcus aureus TadA (saTadA) 与 tRNA 结合的结构数据，推断出活性位点附近可能影响腺嘌呤和胞嘧啶识别及催化的关键氨基酸残基。

关键直觉 (Intuition)：

1. 区分腺嘌呤和胞嘧啶的尺寸差异： 腺嘌呤是嘌呤碱基，比胞嘧啶（嘧啶碱基）大。如果能通过突变改变活性位点的空间结构或电荷分布，使其对较小的胞嘧啶结合不利，或对其脱氨基反应效率降低，同时保持对腺嘌呤的催化效率，就可以减少旁观者胞嘧啶编辑。
2. DNA 骨架接近活性位点： 对于胞嘧啶脱氨基，其嘧啶环需要与嘌呤碱基的六元环处于相同位置，这需要糖-磷酸骨架向活性位点边缘移动。因此，引入更大的氨基酸残基或带负电荷的残基，可能会阻止 DNA 骨架接近活性位点边缘，从而抑制胞嘧啶编辑。
3. TadA 直系同源物的演化： 不同的 TadA 直系同源物可能已经演化出避免胞嘧啶编辑的机制。通过比对这些序列中活性位点附近的差异，可以识别出潜在的关键氨基酸。

4.2. 核心方法详解 (逐层深入)

4.2.1. 鉴定现有 ABE 变体中的旁观者胞嘧啶编辑

研究首先验证了当前可用的 ABE 变体是否存在旁观者胞嘧啶编辑。

• 实验对象： ABEmax-F148A, ABEmax-AW, SECURE-ABEs (旨在减少 RNA 脱靶效应的版本)，ABE8e, ABE8e-V106W, ABE8s (高活性版本)。

• 靶点： 两个内源性靶点（FANCF 和 RNF2 基因），这些靶点在编辑窗口内同时包含腺嘌呤和胞嘧啶目标基序。

• 细胞系： HEK293T 细胞。

• 检测方法： 高通量测序 (High-throughput sequencing)。

  结果： 所有测试的 ABE 变体除了腺嘌呤编辑外，均诱导了胞嘧啶编辑 (Figure 1b, Supplementary Figure 1)。ABEmax-F148A 和 ABEmax-AW 胞嘧啶编辑率略有降低，表明通过进一步工程化 eTadA 有可能消除或最小化其胞嘧啶脱氨基活性。ABE8 变体腺嘌呤和胞嘧啶转换率均增加，但 ABE8e-V106W 的胞嘧啶编辑有所减轻。去除或失活 wtTadA 不影响 DNA 编辑活性，ABEmax-m (缺少 wtTadA 的 ABEmax) 甚至表现出更高的 DNA 编辑活性。

以下是原文 Figure 1 的图像，展示了 TadA 变体对 A-to-G 转换率的影响和序列比对：

该图像是一个示意图，展示了不同 TAD 变体对 A-to-G 转换率的影响。图中比较了 wtTadA、eTadA 和多种突变体在 FANCF 和 RNF2 基因座的 A4 和 C6 位点转换效率，同时附带了相关蛋白质序列对照。图中突出了 P48 和 D108 突变的作用，强调了定点突变对编辑活性的影响。

4.2.2. TadA7.10 的理性设计以减少胞嘧啶编辑

为了在腺嘌呤和胞嘧啶之间实现区分，研究人员基于 TadA 直系同源物氨基酸序列比对和 saTadA-tRNA 结构信息，对 TadA7.10 进行了理性设计。

• 序列比对和结构分析：

  • TadA 直系同源物比对： 发现 wtTadA 中的 P48 在大多数 TadA 直系同源物中被精氨酸 (arginine) 替代，而 D108 在其他直系同源物中变为天冬酰胺 (asparagine)、谷氨酸 (glutamate) 或丝氨酸 (serine)。
  • saTadA 结构： saTadA 与 tRNA 片段结合的结构揭示了腺嘌呤和胞嘧啶脱氨基所需的结构变化。腺嘌呤脱氨基需要其六元环深入腺嘌呤结合口袋。而胞嘧啶脱氨基需要其嘧啶环与嘌呤碱基的六元环处于相同位置，这要求糖-磷酸骨架向口袋边缘移动。

• 设计突变策略 (Supplementary Figure 2)：

  1. P48 和 D108 突变：
     • P48R 和 D108Q： 引入更大的氨基酸残基 (如精氨酸或谷氨酰胺) 以阻止 DNA 骨架接近口袋边缘，或引入带负电荷的残基 (如天冬氨酸或谷氨酸) 来排斥骨架磷酸基团。
     • P48： 突变为 P48R (精氨酸在许多 TadA 直系同源物中发现) 或 P48K。还测试了 P48D 和 P48E (带负电荷)。
     • D108： 测试了具有不同大小和性质的残基，如 D108Q, D108E, D108K, D108M, D108F, D108W。
  2. F149A 突变： F149 与 D108 对面的 DNA 骨架紧密相互作用，可能有助于胞嘧啶深入活性位点。将其突变为较小的丙氨酸 (alanine) 可能会抑制此活性。
  3. V30 和 F84 突变： 位于腺嘌呤结合口袋，突变为异亮氨酸 (isoleucine) 和亮氨酸 (leucine)，这些氨基酸在许多 TadA 直系同源物的相应位置发现。例如 F84L 是 wtTadA 中的回突变。

4.2.3. 确定影响胞嘧啶编辑的关键突变

将设计的候选突变引入 ABEmax 或 ABEmax-m 中的 TadA7.10，并测试其核苷酸转换活性。

• 实验对象： 引入各种突变的 TadA7.10 (Supplementary Table 3)。
• 靶点： FANCF 和 RNF2 基因的靶位点。
• 检测方法： 高通量测序。
• 分析： 将 ABE 变体的腺嘌呤和胞嘧啶转换率标准化至 ABEmax。

结果：

• D108Q 突变： 发现 V106W, D108Q, F148A, F149A 四个突变显著降低了胞嘧啶编辑活性，同时保持或略微降低了腺嘌呤编辑活性，从而提高了腺嘌呤编辑的特异性 (Figure 2a)。其中，ABEmax-m 包含 TadA7.10-D108Q (ABEmaxQ-m) 表现出最高的腺嘌呤编辑特异性 (Figure 2b)。

• P48R 突变： TadA7.10-P48R (在 ABEmax-m 中) 显著降低了腺嘌呤编辑率，但增加了胞嘧啶编辑率，从而实现了对胞嘧啶编辑的高特异性 (Figure 2a)。

  以下是原文 Figure 2 的图像，展示了关键突变对胞嘧啶编辑活性的影响：

  该图像是图表，展示了不同突变的腺嘌呤碱基编辑酶（ABE）在A4和C6转换中的编辑活性，包括wtTadA和eTadA的比较。图中突出显示了D108Q突变的显著降低的胞苷去氨基活性，以及其他突变对编辑效率的影响。

4.2.4. D108Q 突变在增强型 ABEs 中的应用及 RNA 脱靶评估

为补偿 ABEmaxQ-m 较低的编辑活性，研究人员将 D108Q 突变引入高活性 ABE 版本 TadA8e 和 TadA8s。

• 构建新的 ABE 变体： ABE8eQ (ABE8e + D108Q), ABE8eWQ (ABE8e + V106W + D108Q), ABE8sQ (ABE8s + D108Q)。
• DNA 编辑活性评估： 在 FANCF, RNF2, ABLIM3, CSRNP3 四个内源性靶点进行测试。
  • 结果： ABE8eQ, ABE8eWQ, ABE8sQ 均表现出增强的腺嘌呤编辑活性，同时胞嘧啶编辑活性降低 (Figure 3a, Supplementary Figure 4)。ABE8eWQ 和 ABE8eWA (ABE8e + V106W + F149A) 被认为是编辑活性和特异性最优化的版本，表明 V106W 与 D108Q/F149A 具有协同效应。
• 编辑窗口分析： 在六个额外内源性靶点 (ABEsites, CCR5-10) 评估 ABE8eWQ 和 ABE8eWA 的编辑窗口。
  • 结果： ABE8eWQ 和 ABE8eWA 表现出略窄的腺嘌呤编辑窗口 (第 4-7 位) (Figure 3b, Supplementary Figure 5)。
• RNA 脱靶编辑评估： 测量 ABEs 在四个代表性 RNA 转录本 (CCNB1IP1, AARS1, PERP, TOPORS) 中的 A-to-I 转换频率。
  • 结果： ABE8e 和 ABE8s 版本 RNA 脱靶效应增加，而 ABE8eW 相比 ABE8e 降低。ABE8eWA 与 ABE8eW 水平相似，但 ABE8eQ, ABE8eWQ, ABE8sQ 显著降低了 RNA 脱靶效应 (Figure 3d)。
  • 机制解释： D108 的羧基在 saTadA-RNA 结构中与结合 RNA 的 2' 羟基形成氢键，D108Q 可能降低 TadA8e 对 RNA 的结合亲和力，但不影响对 DNA 的结合。
• 转录组范围 RNA-seq 验证： 对控制组 (仅 nCas9) 和五种 ABE 变体进行 RNA-seq。

  • 结果： ABE8eWQ 和 ABE8sQ 显著降低了 RNA 脱靶效应，几乎达到控制组水平 (Figure 3e)。

    以下是原文 Figure 3 的图像，展示了 D108Q 突变在增强型 ABEs 中的效果及 RNA 脱靶评估：

    该图像是示意图，展示了不同突变型的腺嘌呤碱基编辑酶（ABE）在腺苷（A）转化和胞嘧啶（C）编辑活性方面的比较。图中显示了 ABE8eWQ 和 ABE8eW 的不同编辑性能，以及它们在 RNA A-to-I 编辑中的表现。

4.2.5. P48R 突变 ABEs 作为 TC 特异性碱基编辑器

利用 TadA7.10-P48R 变体，开发 TC 序列特异性碱基编辑工具。

• 构建 TC 特异性编辑器：
  • 将两个 UGI 拷贝连接到 ABEmax-P48R 的 C 末端，生成 ABEmax-P48R-UGI。
  • 比较六种碱基编辑工具：AncBE4max, AncBE4max(∆UGI) (CBEs), ABEmax, ABEmax-UGI (ABEs), ABEmax-P48R, ABEmax-P48R-UGI (TC 特异性 BEs)。
• 胞嘧啶编辑特异性评估：
  • 靶点： CSRNP3 基因的一个靶位点。
  • 结果： CBEs 转换了编辑窗口内的所有 C，ABEs 转换了所有 A 和 C6，而 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 主要转换 C6 (Figure 4b)。
  • 多靶点验证： 在六个额外内源性靶点 (FANCF, RNF2, ABLIM3, RHPN2, BRME1, LOC101927151) 进行测试。
  • 结果： ABE-P48R 主要将 C 转换为 G，而 ABE-P48R-UGI 主要将 C 转换为 T (Figure 4c, Supplementary Figure 7)。
• 编辑窗口和基序偏好性： 在八个内源性靶点评估编辑窗口 (CLEC4E, EMB, ARHGEF38, CST9L, CLYBL, HOPX, SAE1, SDS)。在九个内源性靶点评估基序偏好性。

  • 结果： 两者都在狭窄的编辑窗口 (第 5-7 位) 转换胞嘧啶 (Figure 4d, Supplementary Figure 8)，并且对 TC 基序有偏好性 (Figure 4e, Supplementary Figure 9)。

    以下是原文 Figure 4 的图像，展示了 P48R 突变 ABEs 的胞嘧啶编辑特异性：

    该图像是图表，展示了不同基因编辑工具（如ABE、ABE-P48R和ABE-P48R-UGI）在腺嘌呤到鸟嘌呤转化（A conversion）、胞嘧啶转化（C conversion）和胞嘧啶编辑率（A editing/C editing）等方面的效果。结果显示出ABE-P48R在胞嘧啶编辑方面的显著变化，明确这些突变对基因编辑活动的影响。

4.2.6. 精确纠正致病性突变

利用 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 纠正 ClinVar 数据库中的致病性突变。

• 数据挖掘： 在 ClinVar 数据库中，36,153 个导致病理表型的 T-to-C 突变位于规范的胞嘧啶碱基编辑窗口 (第 3-8 位)。其中 3,874 个突变与 ABE-P48R-UGI 编辑窗口内的胞嘧啶靶基序相关。23,237 个 G-to-C 突变中，有 3,248 个可被 ABE-P48R 靶向。

• TUBB6 基因 (F394S) 突变纠正 (TC-to-TT)：

  • 建立含 TUBB6 突变的细胞系 (Supplementary Figure 10)。
  • 转染 CBE (AncBE4max) 或 ABE-P48R-UGI。
  • 结果： CBE 产生更高的总胞嘧啶转换率，但精确纠正率较低 (<1% vs 4.1% for ABE-P48R-UGI)。ABE-P48R-UGI 几乎没有旁观者效应，而 CBE 有大量旁观者效应 (Figure 5b)。

• PTPN11 基因 (N58Y) 突变纠正： 结果与 TUBB6 类似 (Figure 5b)。

• TPO 基因 (Q660E) 突变纠正 (TC-to-TG)：

  • 建立含 TPO 突变的细胞系 (Supplementary Figure 10)。
  • 转染 CBE (AncBE4max) 或 ABE-P48R。
  • 结果： CBE 产生更高的总胞嘧啶转换率，但精确纠正率较低 (<1% vs 3.1% for ABE-P48R)。ABE-P48R 几乎没有旁观者效应，而 CBE 有大量旁观者效应 (Figure 5c)。

• FBN1 基因 (C958S) 突变纠正： 结果与 TPO 类似 (Figure 5c)。

  以下是原文 Figure 5 的图像，展示了精确纠正致病性突变的效果：

  该图像是图表，展示了不同基因编辑工具（CBE、ABE-P48R-UGI、ABE-P48R）在TUBB6、TPO和PTPN11基因位点的编辑效率。图中显示了A到G及C到T的转变情况，以及相应的编辑率和结果对比。数据表中列出了正确和错误的编辑比例，以及总的编辑效率。

5. 实验设置

5.1. 数据集

本研究没有使用传统意义上的“数据集”，而是通过体外实验在人类细胞系中靶向特定的基因组位点。

• 细胞系： HEK293T (ATCC CRL-3216) 细胞，在 DMEM 培养基中培养，补充 10% FBS 和 1% 氨苄西林，在 37°C、5% CO₂ 的湿润培养箱中。
• 内源性靶点：
  • 用于评估 ABE 变体的胞嘧啶和腺嘌呤编辑活性：FANCF, RNF2 (包含腺嘌呤和胞嘧啶靶基序)。
  • 用于进一步验证 ABEmaxQ-m 腺嘌呤编辑特异性：ABLIM3, CSRNP3。
  • 用于评估 ABE8eWQ 和 ABE8eWA 编辑窗口：ABEsites (ABEsite5, ABEsite8, ABEsite10, ABEsite12, ABEsite16), CCR5-10 (包含多个不同位置的腺嘌呤)。
  • 用于评估 ABE8eWQ 和 ABE8eWA 胞嘧啶编辑活性：CLEC4E, EMB, ARHGEF38, CST9L, CLYBL, HOPX, SAE1, SDS (包含不同位置和侧翼核苷酸的 TC 基序)。
  • 用于评估 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 的编辑活性、编辑窗口和基序偏好性：CSRNP3, FANCF, RNF2, ABLIM3, RHPN2, BRME1, LOC101927151 (包含不同位置的 TC 和 A 核苷酸)；BRD4, C10orf62, RBFOX2, FGF17, CHM, FAM171A1, FANCF, ABLIM3, CSRNP3, BRME1, LOC101927151, ELOF1, FLYWCH1, HAGH (胞嘧啶固定在第 6 位，具有不同基序 AC, GC, CC)。
• ClinVar 数据库： 用于筛选与人类疾病相关的致病性突变，以验证 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 的治疗潜力。
• 构建的突变细胞系： 为了模拟疾病状况，通过敲入 (knock-in) 技术在 HEK293T 细胞中引入了以下致病性突变：
  • TUBB6 基因中的错义突变 (导致 F394S 变化)，需纠正 TC 到 TT。
  • PTPN11 基因中的错义突变 (导致 N58Y 变化)。
  • TPO 基因中的错义突变 (导致 Q660E 变化)，需纠正 TC 到 TG。
  • FBN1 基因中的错义突变 (导致 C958S 变化)。

5.2. 评估指标

本研究主要通过高通量测序分析基因组 DNA 和 RNA 来评估碱基编辑的效率和特异性。

• 核苷酸转换效率 (Nucleotide Conversion Efficiency)：
  • 概念定义： 指示特定碱基（如腺嘌呤或胞嘧啶）在目标位点被成功编辑为预期碱基的百分比。它是衡量编辑工具活性的直接指标。
  • 数学公式： $$\text{Conversion Efficiency} = \frac{\text{Number of Edited Bases}}{\text{Total Number of Bases at Target Position}} \times 100\%$$
  • 符号解释：
    • $\text{Number of Edited Bases}$：在目标位点被成功转换的碱基数量。
    • $\text{Total Number of Bases at Target Position}$：在目标位点读取到的总碱基数量。
• 腺嘌呤编辑特异性 (Adenine Editing Specificity)：
  • 概念定义： 衡量 ABE 优先编辑腺嘌呤而非旁观者胞嘧啶的能力。通常通过腺嘌呤编辑率与胞嘧啶编辑率的比值或差异来体现。高特异性意味着在实现目标 A-to-G 转换的同时，对胞嘧啶的非预期编辑较少。
  • 数学公式： 在本文中，主要通过比较腺嘌呤和胞嘧啶的转换率来定性评估，或通过计算其比值。例如，如果 log₂[fold change] 大于 0，表示腺嘌呤编辑特异性更高。
  • 符号解释：
    • $\text{Adenine Conversion Rate}$：腺嘌呤的转换效率。
    • $\text{Cytosine Conversion Rate}$：胞嘧啶的转换效率。
• RNA A-to-I 转换频率 (RNA A-to-I Conversion Frequency)：
  • 概念定义： 衡量 ABE 介导的脱靶 RNA 编辑水平。RNA 中的腺嘌呤 (A) 被脱氨基为肌苷 (I)，在测序时肌苷会被读作鸟嘌呤 (G)，因此通过检测 RNA 中 A-to-G 转换的频率来评估 RNA 脱靶效应。低频率表示 RNA 脱靶效应较小。
  • 数学公式： $$\text{RNA A-to-I Frequency} = \frac{\text{Number of A-to-G Conversions in RNA}}{\text{Total Number of Adenosines in RNA}} \times 100\%$$
  • 符号解释：
    • $\text{Number of A-to-G Conversions in RNA}$：在 RNA 测序数据中检测到的 A-to-G 转换数量。
    • $\text{Total Number of Adenosines in RNA}$：在 RNA 测序数据中读取到的总腺嘌呤数量。
• 精确纠正率 (Exact Correction Rate)：
  • 概念定义： 在纠正致病性突变时，指成功将突变碱基精确修复为正常碱基，且没有引入其他非预期编辑（如旁观者编辑）的细胞百分比。这是衡量治疗应用潜力的关键指标。
  • 数学公式： $$\text{Exact Correction Rate} = \frac{\text{Number of Cells with Exact Correction}}{\text{Total Number of Cells Assessed}} \times 100\%$$
  • 符号解释：
    • $\text{Number of Cells with Exact Correction}$：经过编辑后，其基因组被精确纠正的细胞数量。
    • $\text{Total Number of Cells Assessed}$：用于评估的总细胞数量。
• 旁观者效应 (Bystander Effects)：
  • 概念定义： 指在目标编辑位点附近，对非目标碱基发生的非预期编辑。在本文中，特别关注了胞嘧啶的旁观者编辑。低的旁观者效应是编辑工具安全性和精确性的标志。
  • 数学公式： 通常通过测量目标位点附近非目标碱基的转换率来评估，没有统一的单一公式，而是通过定性或定量分析非目标编辑的程度。

5.3. 对比基线

本研究将自己开发和改造的 ABE 变体与以下基线模型进行了比较：

• ABEmax： 一种常用的腺嘌呤碱基编辑器，作为比较腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的标准。

• ABEmax-m： 缺少野生型 TadA (wtTadA) 的 ABEmax 版本，用于评估 wtTadA 对 DNA 编辑活性的影响。

• ABEmax-F148A, ABEmax-AW, SECURE-ABEs： 这些是先前为减少 RNA 脱靶效应而开发的 ABE 版本，用于比较其胞嘧啶旁观者编辑的水平。

• ABE8e, ABE8e-V106W, ABE8s： 最新开发的高活性 ABE 版本，用于评估 D108Q 突变在这些高活性背景下的效果，以及与已知的 V106W 突变（减少 RNA 脱靶）的兼容性。

• AncBE4max, AncBE4max(∆UGI)： 优化的胞嘧啶碱基编辑器 (CBEs)，用于与本文开发的 TC 特异性编辑器 (ABE-P48R, ABE-P48R-UGI) 进行比较，特别是在纠正致病性突变时，评估其精确纠正率和旁观者效应。

  这些基线模型代表了 ABE 技术发展的不同阶段和主要优化方向（如高活性、低 RNA 脱靶），通过与它们比较，能够全面评估本文所提出的新工程化 ABE 变体在活性、特异性和脱靶效应方面的优势。

6. 实验结果与分析

6.1. 核心结果分析

本研究通过一系列实验，系统地评估了 TadA7.10 突变体对腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的影响，并成功开发出具有优化特性的新型碱基编辑器。

1. 现有 ABE 变体中的旁观者胞嘧啶编辑普遍存在：

• 研究首先确认，包括 ABEmax-F148A, ABEmax-AW, SECURE-ABEs, ABE8e, ABE8e-V106W 和 ABE8s 在内的所有测试 ABE 变体，在进行腺嘌呤编辑的同时，都会诱导胞嘧啶编辑 (Figure 1b, Supplementary Figure 1)。这表明旁观者胞嘧啶编辑是 ABE 技术的一个普遍问题。
• 尽管 ABEmax-F148A 和 ABEmax-AW 略微降低了胞嘧啶编辑率，但 ABE8 变体在提高腺嘌呤编辑率的同时，也增加了胞嘧啶转换率。ABE8e-V106W 表现出胞嘧啶编辑减轻，这提示了工程化 TadA 存在减少旁观者胞嘧啶编辑的可能性。

2. D108Q 突变显著降低胞嘧啶旁观者编辑和 RNA 脱靶编辑：

• 通过理性设计和筛选，发现 TadA7.10 中的 D108Q 突变 (以及 V106W, F148A, F149A) 能够显著降低胞嘧啶编辑活性，同时保持或略微降低腺嘌呤编辑活性，从而提高了腺嘌呤编辑的特异性 (Figure 2a)。
• 在优化后的 ABE8eWQ (ABE8e + V106W + D108Q) 中，腺嘌呤编辑活性得到增强，而胞嘧啶编辑活性显著降低 (Figure 3a, Supplementary Figure 4)。这表明 D108Q 突变在高效 ABE 版本中也有效，并且与减少脱靶的 V106W 突变具有协同效应。
• 更重要的是，D108Q 突变也大大降低了 ABE 的 RNA 脱靶编辑效应。RNA-seq 结果显示，ABE8eWQ 和 ABE8sQ 的 RNA 脱靶效应显著降低，几乎与对照组水平相当 (Figure 3d, 3e)。这使得 ABE8eWQ 成为一个兼顾高腺嘌呤编辑活性、高特异性（低胞嘧啶旁观者编辑）和低 RNA 脱靶效应的优选版本。

3. P48R 突变产生 TC 特异性碱基编辑器：

• 令人意外的是，TadA7.10 中的 P48R 突变表现出与 D108Q 相反的效果：它显著提高了胞嘧啶编辑活性，同时大幅降低了腺嘌呤编辑率 (Figure 2a)。
• 利用这一特性，研究人员开发了 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI。实验证明，这些工具能够特异性地在 TC 基序中编辑胞嘧啶，并且编辑窗口较窄 (第 5-7 位)，对 TC 基序有明显偏好 (Figure 4b, 4d, 4e)。
• ABE-P48R 主要催化 C-to-G 转换，而与 UGI 融合的 ABE-P48R-UGI 则主要催化 C-to-T 转换 (Figure 4c, Supplementary Figure 7)。这些 TC 特异性编辑器在纠正致病性突变时，表现出极低的旁观者编辑效应，远优于传统的胞嘧啶碱基编辑器 (CBEs)，从而实现了更精确的基因修复 (Figure 5b, 5c)。

4. 临床应用潜力：

• ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 成功地在模拟疾病状态的细胞系中，以高精确度纠正了 TUBB6 (F394S, TC-to-TT), PTPN11 (N58Y, TC-to-TT), TPO (Q660E, TC-to-TG) 和 FBN1 (C958S, TC-to-TG) 等致病性错义突变。
• 与传统 CBEs 相比，这些 TC 特异性编辑器在精确纠正率上具有显著优势，并且旁观者编辑效应几乎可以忽略不计 (Figure 5b, 5c)。这突显了它们在基因治疗中作为精确编辑工具的巨大潜力。

6.2. 数据呈现 (表格)

本研究中的数据主要通过图表（如条形图、热图、散点图）和 Supplementary Table 来呈现，原文正文中未包含可直接转录的表格。但是，我将根据 Figure 5 中的数据，以 HTML 表格形式呈现其核心纠正效率数据，以便更清晰地展示。

以下是原文 Figure 5b 和 5c 中的关键数据转录：

分析：

• TUBB6 和 PTPN11 基因的 TC-to-TT 纠正：

  • 传统的胞嘧啶碱基编辑器 (CBE) 能够实现较高的总胞嘧啶转换率 (TUBB6 为 12.7%，PTPN11 为 13.6%)。然而，其精确纠正率都低于 1%，这意味着大量的胞嘧啶转换是旁观者编辑，而非目标精确纠正。
  • ABE-P48R-UGI 尽管总胞嘧啶转换率相对较低 (TUBB6 为 4.1%，PTPN11 为 6.8%)，但其精确纠正率与总转换率持平，即几乎所有编辑都是精确纠正，旁观者效应为 0%。这表明 ABE-P48R-UGI 在 TC-to-TT 转换方面具有极高的特异性。

• TPO 和 FBN1 基因的 TC-to-TG 纠正：

  • CBE 在这些位点的总胞嘧啶转换率分别为 2.8% 和 10.3%，但精确纠正率同样低于 1%。

  • ABE-P48R 在 TPO 和 FBN1 基因中的总胞嘧啶转换率分别为 3.1% 和 5.5%，其精确纠正率也与总转换率相同，旁观者效应为 0%。这证明 ABE-P48R 在 TC-to-TG 转换方面也具有出色的特异性。

    这些数据有力地支持了本研究的核心发现：D108Q 突变有效减少了 ABE 的旁观者胞嘧啶编辑和 RNA 脱靶效应，而 P48R 突变则成功地将 ABE 转化为具有高度特异性且旁观者效应可忽略不计的 TC 特异性碱基编辑器，为精确纠正致病性突变提供了新的有效工具。

6.3. 消融实验/参数分析

本研究没有进行严格意义上的消融实验，但通过以下方式验证了不同突变（包括组合突变）对编辑效果的影响，可以视为一种参数或组件分析：

• 系统性突变筛选： 作者通过对 TadA7.10 引入一系列理性设计的突变（如 P48H, P48R, P48K, P48D, P48E, D108Q, D108E, D108K, D108M, D108F, D108W, F149A, V30I, V30L, F84I, F84L 等），并测试了它们对腺嘌呤和胞嘧啶编辑活性的影响 (Figure 2a)。这允许研究人员识别出影响胞嘧啶编辑的关键残基。

  • D108Q 的影响： D108Q 显著降低了胞嘧啶编辑活性，同时保持了腺嘌呤活性，从而提高了腺嘌呤编辑特异性。D108F 和 D108W 突变则大幅降低了腺嘌呤和胞嘧啶的编辑活性，这可能与残基过大，限制了糖-磷酸骨架的接近有关。D108E 完全消除了活性，可能是由于谷氨酸的羧基与骨架磷酸之间的强烈电荷排斥。D108K 仅导致轻微降低，表明赖氨酸-磷酸相互作用影响不大。D108M 相比 D108Q 降低更多，暗示谷氨酰胺与糖-磷酸骨架之间的极性相互作用或水介导的相互作用对催化活性至关重要。
  • P48R 的影响： P48R 突变大幅降低了腺嘌呤编辑率，但增加了胞嘧啶编辑率，导致对胞嘧啶编辑的高度特异性 (Figure 2a)。其他影响 P48 的突变也类似地降低了腺嘌呤/胞嘧啶编辑比，暗示 P48 处残基的构象变化可能通过影响邻近残基（如 N46 与嘌呤环的相互作用）或与骨架磷酸的相互作用来调控胞嘧啶特异性。

• 组合突变分析：

  • ABE8eWQ (V106W/D108Q) 和 ABE8eWA (V106W/F149A)： 将 D108Q 和 F149A 突变与 V106W 结合，并引入高活性 ABE8e 背景中。结果表明，V106W 与 D108Q 和 F149A 具有协同效应，进一步优化了编辑活性和特异性 (Figure 3a)。这验证了这些突变的兼容性和叠加效应。
  • D108Q 对 RNA 脱靶的影响： D108Q 突变与 V106W 结合后，显著降低了 RNA 脱靶效应 (Figure 3d, 3e)，这在转录组范围内得到了 RNA-seq 的验证。这一发现揭示了 D108Q 在兼顾 DNA 编辑特异性和 RNA 安全性方面的多重益处。

• UGI 对 C-to-T 转换的影响： 比较 ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 的编辑结果，发现添加 UGI 能够将胞嘧啶编辑的主要产物从 C-to-G 转换为 C-to-T (Figure 4c)。这证实了 UGI 在抑制尿嘧啶 DNA 糖基化酶活性、从而偏好 C-to-T 转换中的关键作用。

  这些分析虽然不是典型的消融实验，但通过对比不同突变及其组合的效果，系统性地揭示了关键氨基酸残基在调控 TadA 活性和特异性中的作用，并为开发新型碱基编辑器提供了指导。

7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究通过对腺嘌呤脱氨酶 TadA7.10 进行深入的理性设计和工程改造，取得了以下关键进展：

1. 发现了 D108Q 突变是减少 ABE 旁观者胞嘧啶编辑和 RNA 脱靶的关键。 该突变将胞嘧啶脱氨基活性降低了十倍，并且与已知的减少脱靶编辑的 V106W 突变兼容。这使得 ABE8eWQ 等新型 ABE 变体在保持高腺嘌呤编辑效率的同时，显著提高了编辑特异性和安全性。D108Q 突变影响了 TadA 对 RNA 的结合亲和力，从而降低了 RNA 脱靶效应。

2. 开发了 P48R 突变介导的 TC 特异性碱基编辑器。 P48R 突变显著降低了腺嘌呤编辑，但增加了胞嘧啶编辑，使其能够特异性地靶向 TC 序列。通过与 UGI 融合，ABE-P48R 和 ABE-P48R-UGI 能够分别实现 TC-to-TG 和 TC-to-TT 的精确转换，且旁观者编辑效应可忽略不计。

3. 验证了新型编辑工具在疾病纠正中的潜力。 这些工程化的 ABE 变体，特别是 TC 特异性编辑器，能够高精度地纠正 ClinVar 数据库中与人类疾病相关的致病性突变，表现出优于传统胞嘧啶碱基编辑器的精确纠正率和更低的旁观者效应。

   总体而言，本研究不仅通过减少旁观者胞嘧啶编辑和 RNA 脱靶效应提升了 ABE 的精确性和安全性，还通过开发 TC 特异性工具拓展了碱基编辑器的功能，为基因治疗和基础研究提供了更强大、更精细的工具。

7.2. 局限性与未来工作

作者指出的局限性： 论文在讨论部分主要强调了其发现的机制和重要性，但并未明确指出自身方法的局限性。然而，我们可以根据已有的实验结果和领域知识推断一些潜在局限性。

潜在局限性：

1. 编辑效率仍有提升空间： 尽管优化后的 ABE8eWQ 表现出优异的特异性，但其在某些靶点上的腺嘌呤编辑效率可能仍不如未经优化的、活性更高的 ABE8e。在纠正致病性突变时，精确纠正率虽然特异性高，但总的编辑率（例如 ABE-P48R-UGI 在 TUBB6 中 4.1%）可能仍需进一步提升以满足临床应用需求。
2. 编辑窗口和基序限制： TC 特异性编辑器虽然精确，但其编辑窗口狭窄 (第 5-7 位) 且对 TC 基序有偏好。这意味着并非所有需要 C-to-G 或 C-to-T 转换的位点都能被有效靶向。对于非 TC 基序的 C 转换需求，仍需要开发新的工具。
3. 脱靶效应的全面评估： 尽管本研究在 RNA 和特定 DNA 位点评估了脱靶效应，但基因组范围的非特异性 DNA 脱靶编辑（sgRNA 依赖和非依赖）仍需更全面的评估。
4. 体内验证： 本研究主要在 HEK293T 细胞中进行，其在体内（如动物模型或患者）的安全性、有效性和免疫原性仍需进一步验证。
5. D108Q 和 P48R 突变深层机制的精细化： 尽管论文通过结构和序列分析提出了 D108Q 和 P48R 突变影响编辑特异性的可能机制，但更深入的分子动力学模拟或更高分辨率的结构生物学研究（例如突变体 TadA 与 DNA 结合的晶体结构）可以提供更详细的原子水平解释。

未来工作方向：

1. 进一步优化编辑效率和适用性： 结合更多工程化策略，进一步提高这些高特异性 ABEs 的编辑效率，并拓展其可编辑的碱基范围和基序。
2. 开发新型 TC 特异性编辑工具： 探索其他策略或突变，以实现更广阔的编辑窗口，或针对非 TC 基序的 C 转换。
3. 更全面的脱靶分析： 利用更敏感的基因组范围脱靶检测方法（如 GUIDE-seq, Digenome-seq）评估优化后 ABEs 的 DNA 脱靶情况。
4. 体内应用研究： 在各种疾病模型中验证这些新型 ABEs 的治疗潜力，包括递送策略、组织特异性编辑和长期安全性。
5. 与其他基因编辑技术的结合： 探索将这些优化的 ABEs 与其他新兴的基因编辑技术（如 C-to-G 或 C-to-A 转换工具）相结合，实现更复杂的基因组改造。

7.3. 个人启发与批判

个人启发：

1. 理性设计与定向进化的结合： 本文展示了理性设计与定向进化策略相结合的强大潜力。通过对生物分子结构和功能的理解进行理性预测，并辅以系统性的筛选验证，能够高效地解决复杂问题。这对于生物工程领域的工具开发具有普遍指导意义。
2. 副作用的转化利用： P48R 突变将 ABE 的“副作用”（高胞嘧啶编辑）转化为一种新的功能（TC 特异性胞嘧啶编辑器），这是一种非常巧妙的创新思维。它启发我们在面对技术缺陷时，不应只考虑消除，有时也可尝试将其转化为新的优势或应用。
3. 精细化编辑的重要性： 旁观者编辑和脱靶效应是基因编辑工具走向临床应用的主要障碍。本研究通过精细化工程改造，显著降低了这些不良效应，强调了基因编辑领域对“精确性”和“安全性”的极致追求。精确纠正致病性突变的能力，使得这些工具在未来基因治疗中具有巨大的潜力。
4. 多层级调控机制： D108Q 突变能够同时影响 DNA 胞嘧啶编辑和 RNA 脱靶，暗示了 TadA 活性位点与不同底物（DNA 和 RNA）相互作用的复杂性，以及单个关键残基可能存在的跨功能调控能力。

批判与可以改进之处：

1. 结构-功能关联的深入探索： 虽然论文提出了 D108Q 和 P48R 突变影响活性的可能机制（如空间位阻、电荷排斥、氢键等），但这些解释主要基于推测和现有结构数据。如果能提供突变体 TadA 与 DNA 底物结合的更高分辨率晶体结构，将能更直接地揭示这些突变如何精确地改变活性位点构象，从而实现对腺嘌呤和胞嘧啶的区分，这将是强有力的补充。
2. 编辑窗口外的影响： 论文主要关注了编辑窗口内的旁观者胞嘧啶编辑。然而，在编辑窗口之外，尤其是基因组层面上，D108Q 突变对广谱 DNA 脱靶效应的影响（不仅仅是 sgRNA 依赖的）仍需更全面的评估。
3. 细胞类型和物种的泛化性： 本研究主要在 HEK293T 细胞系中进行。不同的细胞类型甚至不同物种，其细胞内环境（如碱基修复机制、核苷酸池浓度）可能不同，这可能影响 ABE 的活性和特异性。在多种生理相关细胞模型中验证这些发现将增强其普适性。
4. 免疫原性： 作为基因治疗工具，TadA 蛋白及其突变体的免疫原性是一个重要的考虑因素。尽管本研究未涉及，但在临床转化前，对其在体内是否会引发宿主免疫反应需要进行评估。
5. TC 特异性编辑器的效率提升： 尽管 TC 特异性编辑器的精确纠正率很高，但其总体编辑效率相对较低。未来研究可以探索如何在不牺牲特异性的前提下，进一步提高这些工具的整体编辑效率，以更好地满足疾病治疗的需求。