1. 论文基本信息

1.1. 标题

Screening and transcriptomic analysis of anti-Sporothrix globosa targeting AbaA （针对 AbaA 靶点的抗球孢子丝菌药物筛选及转录组学分析）

1.2. 作者

• Ying Wang, Xiyuan Fan, Fangliang Zheng (Academy of Life Science, Liaoning University, Shenyang, China)
• Xiaoyan Wu, Chanxu Han, Zhenying Zhang (Department of Dermatology, University of Hong Kong Shenzhen Hospital; The Eighth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, Shenzhen, China)
• 通讯作者: Zhenying Zhang, Fangliang Zheng

1.3. 发表期刊/会议

Frontiers in Microbiology （这是一个在微生物学领域具有较高声誉的开放获取期刊，主要发表关于微生物与宿主相互作用、微生物生态学、系统生物学等方面的研究。）

1.4. 发表年份

2025年（根据提供的元数据，发表日期为 2025-04-29）

1.5. 摘要

球孢子丝菌病（Sporotrichosis）是由申克孢子丝菌复合体（Sporothrix schenckii complex）引起的一种真菌病，会导致人和动物表皮及皮下组织的慢性感染。本研究针对关键基因 abaA 进行虚拟筛选，以寻找治疗球孢子丝菌病的小分子药物。研究测定了球孢子丝菌（S. globosa）和申克孢子丝菌（S. schenckii）的生长曲线、最低杀菌浓度（MBC）和最低抑菌浓度（MIC）。通过动物实验探索了药物的功能，并利用 qRT-PCR 和转录组分析验证了 abaA 基因在孢子丝菌中的重要作用。结果发现，阿兹拉斯丁（Azelastine）和美氟喹（Mefloquine）能有效抑制孢子丝菌，减少小鼠皮肤损伤，改善炎症浸润和肉芽肿形成。转录组和 qRT-PCR 结果表明，abaA 在调节孢子丝菌细胞壁对宿主基质的附着和黑色素调节中起着至关重要的作用。

1.6. 原文链接

/files/papers/6959d82c5411c3e2652eaee4/paper.pdf (Open Access)

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2. 整体概括

2.1. 研究背景与动机

• 核心问题: 孢子丝菌病是一种常见的真菌感染，主要病原体包括球孢子丝菌（S. globosa）。目前治疗选择有限（主要是伊曲康唑等），且耐药性问题日益严重，治疗周期长，副作用多。
• 研究空白: 针对球孢子丝菌的新靶点和新药物开发相对滞后。特别是对于该真菌从环境形态（菌丝相）向致病形态（酵母相）转换的关键调控机制及其作为药物靶点的潜力，研究尚不充分。
• 创新思路: 本文选择了一个新的潜在药物靶点——AbaA 蛋白（一种与真菌发育和形态转换密切相关的转录因子）。作者结合了计算机辅助药物设计（虚拟筛选）和传统的生物学验证实验，试图通过“老药新用”（Drug Repurposing）策略，从 FDA 批准的药物库中筛选出能抑制 AbaA 的药物，从而治疗孢子丝菌病。

2.2. 核心贡献/主要发现

1. 新靶点验证: 确认了 abaA 基因在球孢子丝菌的形态转换（双相转换）和致病性中起关键作用。

2. 药物发现: 通过虚拟筛选发现了两种 FDA 批准的老药——阿兹拉斯丁（Azelastine，一种抗组胺药）和美氟喹（Mefloquine，一种抗疟药），它们对球孢子丝菌具有显著的抗真菌活性。

3. 机制解析: 揭示了药物作用机制，即通过抑制 AbaA，导致真菌细胞壁结构蛋白（如 EglC）和黑色素合成相关基因下调，同时触发真菌的应激修复反应。

4. 体内外有效性: 在体外实验和小鼠模型中均证实了这两种药物能有效抑制真菌生长并减轻感染症状。

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3. 预备知识与相关工作

3.1. 基础概念

为了理解本文，初学者需要掌握以下概念：

• 双相真菌 (Dimorphic Fungi): 这类真菌具有两种形态。在环境温度（如 25°C）下以菌丝（Mycelium/Mold）形式存在，通常无致病性；而在宿主体内温度（37°C）下会转换为酵母（Yeast）形式，这是其致病形态。阻断这种转换是治疗的关键策略。
• AbaA 基因: 这是一个编码转录因子的基因。在曲霉属（Aspergillus）等真菌中，AbaA 调控无性繁殖结构（分生孢子梗）的发育。在双相真菌中，它被认为参与了形态转换过程。
• 虚拟筛选 (Virtual Screening) & 分子对接 (Molecular Docking): 一种计算机辅助药物设计技术。想象蛋白质是一个“锁”（Target），药物是一个“钥匙”（Ligand）。分子对接就是用计算机模拟成千上万把钥匙插入锁孔的过程，计算结合的紧密程度（结合能），从而筛选出最可能的候选药物。
• MIC (最低抑菌浓度) & MBC (最低杀菌浓度): 衡量抗生素或抗真菌药物效力的标准指标。MIC 是指能肉眼抑制微生物生长的最低药物浓度；MBC 是指能杀死 99.9% 微生物的最低浓度。
• 老药新用 (Drug Repurposing): 发掘已获批上市药物（已被证明对人体安全）的新疗效。这可以大大缩短新药研发的周期和成本。

3.2. 前人工作

• AbaA 的功能: 之前的研究（如 Borneman et al., 2000）表明，在马尔尼菲篮状菌（Talaromyces marneffei）中，abaA 同源基因参与了从菌丝相到酵母相的转换。如果缺失该基因，真菌发育会受阻。

• 治疗现状: 目前主要使用伊曲康唑（Itraconazole）、特比萘芬等药物，但存在疗程长（数月）、副作用和耐药性问题。

• 技术背景: 随着耐药菌株的出现，结合生物信息学（寻找靶点）和化学信息学（筛选药物）成为开发新型抗真菌药物的重要趋势。

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4. 方法论

本文采用了一套从“干实验”（计算机模拟）到“湿实验”（生物验证）的完整流程。

4.1. 虚拟筛选与分子对接

这是发现药物起点的关键步骤。

1. 靶点获取: 获得了 S. globosa 的 abaA 基因序列。由于其三维结构未知，作者利用 Robetta 服务器进行了同源建模（Homology Modeling），预测了 AbaA 蛋白的三维结构。

2. 结合位点预测: 使用 DoGSiteScorer 工具预测了蛋白上的“口袋”（Pockets），即药物分子可能结合的区域（主要是 DNA 结合结构域）。

3. 分子对接: 使用 AutoDock Vina 软件，将 FDA 批准的小分子药物库中的分子与 AbaA 的结合口袋进行批量对接。

4. 筛选标准: 根据结合能（Binding Energy，越低越好）、价格、药效团和副作用进行综合评估，最终选中了 Azelastine 和 Mefloquine。

   下图（原文 Figure 1）展示了这一过程：(A) AbaA 蛋白的三维结构模型；(F) 预测的结合口袋；(G, H) 筛选出的药物分子（阿兹拉斯丁和美氟喹）与蛋白的对接构象。

   该图像是多种结构蛋白的示意图，展示了Sporothrix globosa中的关键蛋白质构象，包括A至H各个部分，特别强调了abaA基因的重要性和其在治疗真菌病中的潜力。

4.2. 体外抗真菌活性测试 (In Vitro)

验证计算机预测的药物是否真的有效。

1. 菌株培养: 将 S. globosa 和 S. schenckii 在 25°C 培养（菌丝相），并通过 37°C 诱导转换为酵母相。
2. 药敏试验 (MIC/MBC): 参照 CLSI 标准（临床实验室标准化协会），在 96 孔板中进行微量稀释法。
   • MIC 判定: 观察孔内是否浑浊（真菌生长），结合光密度值 $OD_{625}$。
   • MBC 判定: 将无生长孔的液体涂布到平板上，看是否有菌落生长。
3. 生长曲线测定: 在含有药物的培养基中培养真菌，每 12 小时测量一次 $OD_{625}$ 值，绘制 96 小时内的生长趋势图。

4.3. 动物实验 (In Vivo)

在生物体内验证药物疗效。

1. 模型建立: 使用 KM 小鼠，先注射皮质醇（Cortisol）进行免疫抑制（模拟易感人群），然后皮内注射孢子悬液感染。

2. 分组治疗:

   • 对照组（Control）：仅给溶剂。
   • 阳性对照组（Itraconazole）：给予标准药物伊曲康唑。
   • 实验组：Azelastine 和 Mefloquine 分别设置高、低剂量组。
   • 给药方式：灌胃（Gavage）。

3. 评估: 观察皮肤病变（结节、溃疡），并在治疗后取皮肤组织进行 HE 染色（苏木精-伊红染色），观察肉芽肿（Granuloma）的大小和炎性细胞浸润情况。

   下图（原文 Figure 4）展示了动物实验的流程时间轴：免疫抑制 -> 感染 -> 给药 -> 观察。

   该图像是一个示意图，展示了在小鼠实验中处理 Sporothrix 的步骤，包括注射孢子悬液、推注皮质醇、通过灌胃给药及移除皮肤损伤的时间节点。

4.4. 转录组学分析与机制验证

探究药物是如何通过影响 abaA 进而杀死真菌的。

1. RNA 测序 (RNA-seq): 提取不同处理组（菌丝相 MP、酵母相 YP、酵母相+药物 YPA）的总 RNA，构建 cDNA 文库并测序。
2. 差异表达分析: 使用 DESeq2 软件分析基因表达差异。
3. 功能富集: 使用 GO（基因本体）和 KEGG（代谢通路）数据库分析差异基因的功能。
4. qRT-PCR 验证: 使用实时荧光定量 PCR 验证关键基因的表达量变化。
   • 计算公式: 使用 $2^{-\Delta\Delta Ct}$ 方法计算相对表达量。 $$\text{Relative Expression} = 2^{-\Delta\Delta Ct}$$
   • 符号解释:

     • Ct: 循环阈值（Cycle threshold），荧光信号达到设定阈值时的循环数。

     • $\Delta Ct = Ct_{\text{target}} - Ct_{\text{reference}}$ （目标基因与内参基因 18S rDNA 的差值）。

     • $\Delta\Delta Ct = \Delta Ct_{\text{treatment}} - \Delta Ct_{\text{control}}$ （处理组与对照组的差值）。

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5. 实验设置

5.1. 数据集与菌株

• 菌株: Sporothrix globosa 和 Sporothrix schenckii。这些菌株由辽宁大学病原真菌研究中心维护。
• 药物库: FDA 批准的小分子药物库（用于虚拟筛选）。

5.2. 评估指标

• 结合能 (Binding Energy): 单位通常为 kcal/mol。数值越负，表示药物与蛋白质结合得越紧密、越稳定。
• 光密度 ($OD_{625}$): 在 625nm 波长下的吸光度，用于代表菌液中细胞的浓度（浑浊度）。值越高，真菌生长越旺盛。
• 肉芽肿宽度 (Granuloma width): 单位 $\mu m$。肉芽肿是免疫系统包裹感染源形成的结节。治疗有效通常表现为肉芽肿缩小。
• 炎性细胞计数 (Inflammatory cell count): 单位视野内的免疫细胞数量。数量减少通常意味着炎症减轻。
• TPM (Transcripts Per Million): 每百万条转录本数。用于衡量基因在转录组数据中的表达丰度。

5.3. 对比基线

• 阴性对照: DMSO 溶剂对照组（排除溶剂本身的影响）。

• 阳性对照: 伊曲康唑 (Itraconazole)。这是目前临床治疗孢子丝菌病的一线药物，用于对比新药的疗效是否达到或接近现有标准。

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6. 实验结果与分析

6.1. 药物筛选与体外抑制效果

虚拟筛选锁定了 Azelastine 和 Mefloquine。体外实验证实了它们的活性。

• 形态学观察: 如下通（原文 Figure 2）所示，加入 Azelastine 和 Mefloquine 后，真菌的分生孢子脱落，生长受抑制，且未能发生双相转换（即未能从菌丝相成功转换为致病性的酵母相）。

  该图像是实验结果的示意图，展示了不同药物在不同时间点对目标菌株的抑制效果。包含对照组、DMSO组以及多种药物（如伊曲康唑、阿唑斯坦、氟苯尼考等）在 12h、24h、48h、72h、96h 的培养结果。

• 生长曲线: 如下图（原文 Figure 3）所示，与对照组（Control）和溶剂组（DMSO）相比，添加药物组的 $OD_{625}$ 值显著降低（$p < 0.001$），表明真菌生长被强力抑制。

  该图像是图表，展示了不同药物对Sporothrix globosa和Sporothrix schenckii生长的影响。X轴为时间（小时），Y轴为OD625值。控制组、DMSO组及不同药物组（伊曲康唑、阿兹拉斯丁和美氟喹）的生长情况各有不同，数据分析表明药物对真菌生长具有显著抑制效果，标注有和表示统计学显著性。*

• MIC/MBC 数据: 以下是原文 Table 4 的结果，展示了两种药物的抑菌和杀菌浓度：

  Drug	MIC ($\mu g/mL$)	MBC ($\mu g/mL$)
  Azelastine - S. globosa	25	50
  Mefloquine - S. globosa	12.5	25
  Azelastine - S. schenckii	6.25	50
  Mefloquine - S. schenckii	6.25	25

  分析: Mefloquine 的 MIC 值普遍低于 Azelastine，显示出更强的体外抑菌活性。虽然数值上不如某些强力抗生素低，但考虑到其安全性，仍具开发潜力。

6.2. 体内治疗效果 (小鼠模型)

• 皮肤病变: 如下图（原文 Figure 5）所示，治疗组小鼠的皮肤结节和溃疡明显小于对照组，结痂情况有所改善。

  该图像是图表，展示了不同处理组小鼠皮肤病变的变化情况。0周至4周内，控制组和药物处理组（Itraconazole、Azelastine和Mefloquine）小鼠的皮肤损伤表现出明显差异，部分出现了结节、溃疡和囊肿。

• 组织病理学: 如下图（原文 Figure 6）所示，HE 染色显示对照组有巨大的肉芽肿和大量炎性细胞浸润。

  • Azelastine 组: 肉芽肿分散，未形成团块，炎性细胞浸润较轻。

  • Mefloquine 组: 肉芽肿显著缩小，但炎性细胞浸润并未像 Azelastine 组那样明显改善（Table 6 数据支持这一点，Mefloquine 组炎性细胞计数高于伊曲康唑组）。

    该图像是组织切片的HE染色图，展示了在不同药物处理下的皮肤病变效果。左侧为对照组，包括Mock和Control，右侧显示了针对Sporothrix globosa的治疗药物（如Azelastine和Mefloquine）的不同剂量下的组织反应，采用不同倍数观察，显示了病理变化。

6.3. 转录组机制分析

作者通过对比 菌丝相(MP)、酵母相(YP) 和 加药后的酵母相(YPA) 的基因表达，揭示了药物的作用机理。

• GO/KEGG 富集: 如下图（原文 Figure 7）所示，差异基因主要富集在代谢途径、次级代谢产物生物合成和催化活性上。这表明药物严重干扰了真菌的正常代谢。

  该图像是GO富集分析结果图，包括A、B、C、D、E、F六部分，展示了与Sporothrix相关的基因功能注释及富集程度，提供了不同条件下基因上下调的数量分析，及其显著性水平。各部分通过点图和柱状图形象化表示，强调了abaA基因的重要性以及代谢通路的影响。

• 关键基因变化: 如下图（原文 Figure 8）所示，转录组（Transcriptome）和 qPCR 结果高度一致：

  1. 下调基因 (Down-regulated):
     • EglC (GPI-anchored cell wall beta-1,3-endoglucanase): 细胞壁结构蛋白，与致病性和黏附有关。
     • Scytalone dehydratase: 柱孢酮脱水酶，黑色素合成的关键酶。黑色素能保护真菌免受宿主免疫攻击。
     • CFEM domain protein: 与真菌毒力相关的蛋白。
  2. 上调基因 (Up-regulated):
     • DNA mismatch repair protein (PMS2): DNA 错配修复蛋白。
     • Molecular chaperone HtpG: 分子伴侣，帮助蛋白质折叠。

  • 分析: abaA 被药物抑制后，真菌无法合成足够的细胞壁和黑色素（毒力下降），同时因为受到药物压力，真菌启动了 DNA 修复和应激反应（修复基因上调）试图存活。

    该图像是图表，展示了不同基因在多种培养条件下的转录量（TPM）变化，包括Laccase precursor、Scytalone dehydratas、Molecular chaperone HtpG等。结果以平均值±标准误表示，显著性通过独立样本T检验检测，基线为酵母相（，$p < 0.05$；，$p < 0.01$；，$p < 0.001$）。

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7. 总结与思考

7.1. 结论总结

本研究成功通过靶向 abaA 基因，筛选并验证了 Azelastine 和 Mefloquine 两种老药对球孢子丝菌的治疗潜力。

1. 这两种药物在体外能抑制真菌生长和酵母相转换。
2. 在小鼠体内能有效减轻皮损和肉芽肿。
3. 机制上，药物通过抑制 AbaA 功能，导致关键毒力因子（细胞壁蛋白、黑色素）表达下降，并诱导了真菌的应激修复反应。

7.2. 局限性与未来工作

• 局限性:
  • 药代动力学差异: 小鼠实验的剂量换算到人类可能存在差异，且药物在感染部位（皮下组织）的实际浓度需要进一步研究。
  • 结合模式验证: 虽然进行了分子对接，但缺乏 X 射线晶体衍射或冷冻电镜实验来直接证实药物分子确实结合在 AbaA 蛋白的预测口袋中。
  • 副作用: 尽管是老药，但 Mefloquine 在高剂量下可能有神经毒性，治疗真菌感染所需的剂量安全性需评估。
• 未来工作:
  • 进一步探索药物调节宿主免疫反应的具体机制（特别是 Mefloquine 对炎症的影响）。
  • 基于这些先导化合物（Lead compounds）进行结构优化，开发药效更强、副作用更小的新型衍生物。

7.3. 个人启发与批判

• 启发: 这篇论文是典型的“干湿结合”研究范例。对于缺乏大量资源筛选新化合物的实验室，利用 FDA 老药库进行虚拟筛选是一个极佳的切入点。
• 亮点: 发现抗组胺药（Azelastine）具有抗真菌活性是一个非常有趣的发现，暗示了不同类别药物间可能存在未知的交叉靶点（Off-target effects）。
• 批判: 论文中虽然提到了 AbaA 是靶点，但药物加入后 abaA 自身的表达量变化以及药物是否直接物理结合 AbaA（而非通过其他通路间接影响）的证据主要依赖于转录组推断和模拟，如果能有表面等离子共振（SPR）或热泳动（MST）等实验验证物理结合，结论将更加坚实。此外，Mefloquine 组在减少肉芽肿的同时炎症细胞未明显减少，这提示其抗炎机制可能不如抗真菌机制显著，临床应用需考虑炎症控制。